Экспериментальная оценка новых технологий профилактики и лечения почечной недостаточности

Кирпатовский В.И., Казаченко А.В., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б., Марей М.В., Голованов С.А., Кудрявцев Ю.В., Надточий О.Н., Сыромятникова Е.В.

Острая почечная недостаточность (ОПН) является тяжелым патологическим состоянием, часто сопровождающим хронические заболевания верхних и нижних мочевых путей. Профилактика и лечение этого осложнения до настоящего времени остается серьезной проблемой, так как, несмотря на многолетние исследования, эффективность медикаментозного лечения остается не столь высокой [1, 2]. Современные технологии, использующие новые возможности биологии и медицины, открывают новые перспективы в этом направлении.

В данной работе рассматриваются два перспективных направления в предупреждении и лечении нарушения функции почек: использование нового класса антиоксидантов, избирательно накапливающихся в митохондриях, и клеточных технологий, способных активизировать регенераторный потенциал функционально активных структур органа.

Одним из основных факторов развития как постишемической, так и токсической форм ОПН является лавинообразное усиление продукции активных форм кислорода (АФК), приводящее к окислению и деструкции липидной основы клеточных мембран, индукции избыточного синтеза оксида азота с образованием чрезвычайно токсичного для клеток пероксинитрита и другим негативным последствиям, ведущим к повреждению клеток паренхимы почки и потере ее функциональной полноценности. Патогенетически оправданная терапия традиционными антиоксидантами не оказывает желаемого эффекта из-за того, что не удается создать в клетке достаточно высокую концентрацию антиоксидантов вследствие разрушения ферментными системами печени и/или недостаточно широким терапевтическим диапазоном концентраций препарата [3]. Открытие класса соединений, способных проникать через клеточную мембрану и избирательно накапливаться в митохондриях, создало новые возможности антиоксидантной терапии острого нарушения функции органов, в том числе острой почечной недостаточности [3, 4].

В НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова был синтезирован ряд таких соединений на основе трифенилметилфосфония, 2 из которых (условно названные SkQ1 и SkQR) в модельных опытах показали высокую способность избирательно накапливаться в митохондриях в концентрациях, превышающих их концентрацию в окружающей среде в 1000 раз, и оказывать выраженное антиоксидантное действие [3]. В опытах на культуре почечных клеток эти препараты эффективно предупреждали гибель клеток от окислительного стресса и гипоксии [5].

Другим новым направлением в профилактике и терапии почечной недостаточности, привлекающим пристальное внимание исследователей, является использование клеточных технологий, в частности терапии стволовыми клетками. В мировой и отечественной литературе показано, что гемопоэтические и мезенхимальные (стромальные) стволовые клетки костного мозга принимают участие в регенерации поврежденных почечных структур, а экзогенное введение этих клеток как непосредственно в почку, так и в системный кровоток ускоряют восстановление нарушенной функции этого органа [6-9]. Имеются сведения и о возможном наличии в самой почке резидентных стволовых клеток, также способных участвовать в регенерации компонентов почечной паренхимы [10].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Нами изучены возможности применения новых технологий митохондриально ориентированных антиоксидантов и клеточной терапии для профилактики развития ОПН в эксперименте.

Использование митохондриально ориентированных антиоксидантов. Эффективность применения двух препаратов SkQ1 и SkQR была изучена на модели острой постишемической почечной недостаточности, которую вызывали у крыс путем пережатия сосудистой ножки левой почки на 90 минут с одновременной кон тралатеральной нефрэктомией. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозе 0,2 или 1 мкмоль на крысу за 24 часа до ишемического воздействия. Распределение препарата SkQR в почке изучали через 1, 3, 24 и 72 часа после введения с помощью лазерной конфокальной микроскопии витальных срезов на аппарате LSM 510 фирмы Karl Zeiss (ФРГ). Определение способности SkQR ингибировать продукцию АФК оценивали с помощью конфокальной микроскопии срезов почки, окрашенных флуоресцентным зондом дихлорфлуоресцеином (DCF), проявляющим свечение при взаимодействии с АФК. Противоишемическую эффективность SkQR сравнивали с эффективностью комплекса препаратов а-токоферол + пентоксифиллин. а-токоферол вводили двукратно в дозе 50 мг/кг за 24 и 3 часа до ишемического воздействия, а пентоксифиллин в дозе 5 мг/кг.

Клеточная терапия. В эксперименте изучено влияние 2-х типов стволовых клеток, полученных из аутопсийного материала плодов человека 16-18 недель гестации культивированных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток (КМ-МСК) и суммарной культуры плодных почечных клеток (КПК) при острой постишемической почечной недостаточности (ОПН).

Забор и культивирование материала проводился в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова в соответствии с разработанными методиками [11]. КМ-МСК и КПК в количестве 106 клеток, суспендированных в 0,1 мл физиологического раствора, вводили пункционно в корковое вещество почки, ишемизированной в течение 90 минут, или в нижнюю полую вену сразу же после восстановления почечного кровотока. Распределение введенных клеток изучали через 1 и 7 суток после инъекции в почку КМ-МСК, меченных флуоресцентным зондом Calcein AM.

Для определения влияния антиоксидантной и клеточной терапии на функциональное состояние ишемизированной почки крыс периодически помещали в обменные клетки на 24 часа для сбора мочи и брались образцы крови из хвостовой вены. Биохимические параметры крови и мочи определяли на автоматическом анализаторе ADVIA-2000 (США).

Гистологическое исследование ишемизированных почек осуществляли по стандартной методике с окрашиванием парафиновых срезов гематоксилином и эозином.

Статистическую обработка цифровых данных проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6.0, используя непараметрические методы анализа для малой выборки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты использованиямитохондриально ориентированных антиоксидантов. В предварительных экспериментах определялась динамика накопления препаратов в митохондриях клеток интактной почки, с тем, чтобы определить оптимальное время их введения. Для этого использовали препарат SkQR, обладающий свойством спонтанной флуоресценции за счет включенного в состав молекулы родамина. Оказалось, что S при внутрибрюшинном введении 1 мкМ SkQR через 1 час препарат накапливался преимущественно в клубочках, а через 3 часа происходило равномерное окрашивание практически всех почечных канальцев при исчезновении флуоресценции клубочков (рис. 1А и 1Б). Такая же картина была получена через 24 часа после введения препарата. Через 3 суток отмечено снижение концентрации препарата в канальцах нефрона при практически полном отсутствии флуоресценции клубочков (рис. 1В).


А – через 1 час после введения
А – через 1 час после введения
Б – через 3 часа после введения
Б – через 3 часа после введения
В – через 3 суток после введения
В – через 3 суток после введения

Рисунок 1. Динамика накопления SkQR в срезах почки


Таблица 1. Антирадикальное действие SkQR в зависимости от сроков введения препарата

Срок введения Интенсивность флуоресценции (отн. ед.) % ингибирования
Контроль Опыт
За 6 часов 33 ± 1 18 ± 1* 45%
За 1 сутки 58 ± 3 15 ± 1* 74%
За 3 суток 32 ± 1 25 ± 2* 22%
За 7 суток 53 ± 2 25 ± 2* 51%
* – различия статистически достоверны

Мы сопоставили динамику накопление SkQR в ткани почки с проявлением его антирадикальной активности. В митохондриях почечных канальцев после ишемического воздействия (40 минут ишемии и 10 минут реперфузии) SkQR максимально ингибировал продукцию АФК, оцененную по интенсивности флуоресценции зонда DCF, при введении препарата за 1 сутки до начала ишемии (ингибирование на 74%). При введении SkQR за более короткий период (6 часов) или более длинный период (3 и 7 суток) ингибирующий эффект был достоверно ниже (таблица 1). Исходя из этих данных, в дальнейших исследованиях вводили изучаемые препараты за 1 сутки до ишемического воздействия.

Другой задачей нашего исследования было изучение эффективности SkQ1 и SkQR в предотвращении развития острой постишемической почечной недостаточности.

В контрольной серии опытов (90 минут ишемии единственной почки) в первые 3 суток умерло от уремии 62% крыс, к 7 суткам летальность составила 82%. В экспериментах с введением 1 мкмоль SkQ1 выживаемость в течение 3 суток после ишемического воздействия составила 90%, а к 7 суткам 80%. В более отдаленные сроки (до 3 недель) количество выживших крыс не изменилось. Выживаемость животных в группе с введением 1 мкмоль SkQR была несколько выше, составив 100% через 3 суток и 90% через 7 суток.

Для более детального сравнения противоишемического действия SkQ1 и SkQR нами проведено исследование основных функциональных показателей ишемизированной почки.

В контрольной серии (ишемия / реперфузия) через 3 суток после ишемии у переживших этот срок крыс в большинстве случаев отмечали увеличение диуреза (таблица 2) и только у некоторых животных он практически не менялся. Увеличение диуреза свидетельствовало о полиурической фазе почечной недостаточности, тогда как низкий диурез, по нашему мнению, свидетельствовал о переходе в олигурическую стадию, то есть о более тяжелой степени повреждения почки. Через 7 суток у 2 выживших животных (из 11) сохранялась полиурическая фаза.

В опытах с защитой почек SkQ1 в раннем постишемическом периоде (3 суток) у всех выживших крыс отмечалась выраженная полиурия, которая сохранялась и к 7-м суткам. В условиях противоишемической защиты SkQR выраженного полиурического эффекта не наблюдали. Диурез был ближе к нормальным значениям, а через 7 суток достоверно не отличался от нормы.

Таблица 2. Влияние предварительного введения SkQ1 и SkQR на функциональное состояние ишемизированных почек

Таблица 3. Сравнительная характеристика противоишемической эффективности SkQR и комплекса а-токоферол + пентоксифиллин

Концентрация мочевины в крови через 3 суток после ишемии значительно повышалась во всех исследованных группах, причем в большей степени в опытах с защитой SkQ1 (табл. 2). Менее выраженное повышение концентрации мочевины крови в контрольной серии опытов по сравнению с экспериментами, где проводили защиту антиоксидантами, можно объяснить тем, что в контроле к 3-м суткам погибали животные с наиболее нарушенными функциональными показателями и выживали более резистентные, у которых азотовыделительная функция нарушалась в меньшей степени. К 7-м суткам концентрация мочевины снижалась во всех группах, причем в большей степени в опытах с SkQR, но оставалась достоверно выше нормы. Концентрация креатинина в крови в контрольной серии опытов через 3 суток после ишемии резко повышалась, превышая норму более чем в 10 раз, и высокие значения этого показателя сохранялись через 7 дней после ишемии. В обеих опытных группах концентрация креатинина в крови повышалась в значительно меньшей степени, а в опытах с противоишемической защитой SkQR через 7 дней после ишемии этот показатель снижался до верхней границы нормы.

Таблица 4. Влияние интрапаренхиматозного введения КПК и КМ-МСК на динамику восстановления функционального состояния почек крыс с постишемической ОПН

Таблица 5. Влияние внутривенного введения фетальных КПК и КМ-МСК на динамику функции почки у крыс
с постишемической ОПН (2-я серия)

Поскольку парциальные функции почек могут нарушатьS ся в разной степени, раздельно оценивались изменение клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина и канальцевой реабсорбции по уровню реабсорбции натрия (таблица 2). В контрольной серии опытов происходило резкое (более чем 5-кратное) снижение клиренса креатинина (в анализ входили только выжившие животные с меньшей степенью повреждения почки, чем у погибших). Через 7 суток значения клиренса креатинина возросли незначительно. В экспериментах с защитой обоими антиоксидантами этот показатель через 3 суток после ишемии снижался достоверно в меньшей степени, а к 7-м суткам существенно возрастал, достоверно превышая контрольные значения.

Канальцевая реабсорбция натрия в контрольной серии опытов через 3 суток резко снижалась, а через 7 суток у 2 выживших животных хотя и возрастала, но оставалась значительно ниже нормы. В опытах с защитой SkQ1 через 3 суток средние значения этого показатели были на субнормальном уровне. Через 7 суток реабсорбция натрия полностью нормализовалась. В экспериментах с SkQR канальцевая реабсорбция не ухудшалась даже в первые 3 суток после ишемии и оставалась в нормальных пределах в последующие сутки.

Для сравнения эффективности применения митохондриально ориентированных антиоксидантов с эффективностью традиционных противоишемических препаратов с антиоксидантным действием в отдельной серии экспериментов изучалась выраженность постишемической острой почечной недостаточности у крыс, которым предварительно вводили SkQR, и у животных защищенных предварительным введением комплекса а-токоферол + пентоксифилин, противоишемическая активность которого была доказана ранее [12, 13]. Оказалось, что, хотя оба варианта защиты предупреждали гибель животных от уремии, SkQR в большей степени предупреждал развитие постишемических функциональных и метаболических расстройств, чем комплекс а-токоферол + пентоксифиллин (таблица 3).

Полученные результаты свидетельствуют, что оба митохондриально ориентированных антиоксиданта (SkQ1 SkQR) оказывают выраженное противоишемическое действие, препятствуют гибели животных от ОПН и способствуют сохранению функциональной активности ишемизированного органа. Эффективность SkQR оказалась несколько выше, чем SkQ1 за счет большего защитного эффекта в отношении сохранности канальцевого аппарата почки, что проявилось в предупреждении нарушения реабсорбции натрия и уменьшении степени полиурии (косвенное свидетельство лучшей сохранности способности концентрировать мочу).

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали достаточно высокую эффективность нового класса антиоксидантов, селективно накапливающихся в митохондриях. Дальнейшие исследования должны быть направлены на их использование для предупреждения нарушений функционального состояния почек в клинической практике.

Результаты применения клеточной терапии. В контрольных опытах все животные после моделирования ОПН погибли при явлениях уремии на 2-4 сутки. В опытах с интрапаренхиматозным введением КПК погибло 83% оперированных крыс. После инъекции КМ-МСК ни одна из крыс не погибла от уремии (только одна из них погибла на 9-е сутки по неизвестной причине при улучшающихся показателях функции почки).

При оценке функционального состояния выживших крыс установлено, что после интрапаренхиматозного введения КПК показатели функционального состояния ишемизированной почки оставались нарушенными до 39-го дня наблюдения (таблица 4). В эти сроки клиренс креатинина и реабсорбция натрия сохранялись на субнормальных значениях. Отмечено, что в опытах с интрапаренхиматозным введением КМ-МСК достоверное улучшение показателей функционального состояния ишемизированной почки отмечалось уже на ранних сроках (с 4-го дня постишемического периода). В более отдаленном периоде функция ишемизированной почки нормализовалась к 20-40 дню. Нормальные показатели сохранялись до 80-х суток (максимальный срок наблюдения).

При внутривенном же введении КПК выживаемость крыс с постишемической ОПН составила 50%, а после введения КММСК 83%. Оценка динамики функциональных показателей состояния почки у выживших крыс этой серии опытов показала, что в опытах с внутривенным введением КПК нормализация функции почки происходила уже через 2 недели после ишемического воздействия, но в последующем функциональные показатели несколько ухудшались и в отдаленные сроки находились на субнормальных значениях, за исключением реабсорбции натрия. После введения КМ-МСК функция почки постепенно улучшалась, но в отдаленные сроки также не достигала нормы, за исключением канальцевой реабсорбции натрия (таблица 5).

Сравнительное гистологическое исследование почек через 3 суток после ишемического воздействия показало, что в контрольных группах происходит выраженное повреждение канальцевого аппарата почки, проявляющееся массивной гидропической дистрофией эпителиоцитов с явлениями колликвационного некроза и некробиоза отдельных групп эпителиоцитов (рисунок 2А). Просвет многих канальцев был полностью заполнен эозинофильным содержимым (гиалиновые цилиндры) (рисунок 2Б). После введения КМ-МСК (у погибшей группы крыс) выраженность гидропической дистрофии эпителиоцитов была значительно меньше, некроз и некробиоз эпителиальной выстилки канальцев не отмечены. Констатировано S выраженное полнокровие перитубулярных капилляров, свидетельствующее об интенсификации органной микроциркуляции (рисунок 2В).

А – Контроль. Выраженная гидропическая
А – Контроль. Выраженная гидропическая
Б – Контроль. Просвет канальцев полностью
Б – Контроль. Просвет канальцев полностью
В – Введение КМ-МСК. Умеренно выраженная
В – Введение КМ-МСК. Умеренно выраженная

Рисунок 2. Гистологическая картина почек крыс через 3-е суток после ишемического воздействия. Окраска гематоксилином и эозином. Х 200

Для уточнения судьбы пересаженных стволовых клеток в части опытов проведено инъецирование в почку КМ-МСК, меченных флуоресцентным красителем Calcein AM. При исследовании срезов почки через 1 сутки выявлялось наличие меченых КМ-МСК в месте инъекции и в прилежащих областях, причем все меченые клетки располагались в интерстиции (рисунок 3А). Через 7 суток количество меченых клеток уменьшилось, но они по-прежнему выявлялись в интерстиции почки даже на отдаленном расстоянии от места введения (рисунок 3Б).

Рисунок 3. Распределение введенных КМ-МСК, меченых Calcein AM (зеленая окраска), в интерстиции почки крысы через 1 сутки (А) и через 7 суток (Б) после введения

Таким образом, терапевтическая эффективность разных видов клеток при ОПН оказалась различной и зависела от способа введения. Введение КМ-МСК предотвращало необратимое постишемическое повреждение почек и способствовало более быстрому восстановлению функциональной полноценности органа как при внутрипочечном, так и при внутривенном пути введения, тогда как введение КПК оказывало положительный эффект лишь при введении в системный кровоток. При этом функция органа восстанавливалась более полноценно. По-видимому, терапевтический эффект введенных клеток связан главным образом с паракринным их влиянием, реализующимся через выделение комплекса цитокинов и факторов роста, способствующих усилению микроциркуляции в почке и уменьшению повреждения канальцевого эпителия в раннем постишемическом периоде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований по внедрению новых технологий в арсенал лечебных мероприятий тяжелых острых и хронических нарушений функции почек, часто сопровождающих урологические заболевания. Направленная на митохондрии антиоксидантная терапия и применение стволовых клеток позволяют предупредить необратимое повреждение почек, улучшить их функциональное состояние и избежать летальных осложнений. Такой подход открывает новые перспективы терапевтических возможностей в современной урологии.

Ключевые слова: почечная недостаточность, ОПН, стволовые клетки, антиоксиданты.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Шумаков В.И. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2005. № 3. С. 6-9.
  2. DuBose T.D.Jr.,Warnock D.G., Mehta R.L., Bonventre J.V., Hammerman M.R., Molitoris B.A., Paller M.S., Siegel N.J., Scherbenske J., Striker G.E. // Am. J. Kidney Dis. 1997. Vol. 29. P. 793-799.
  3. Скулачев В.П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения: «мегапроект» по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы. // Биохимия. 2007. T. 72. Вып. 12. C. 1700-1714.
  4. Бакеева Л.Е.. Барсков И.В., Егоров М.В. и др. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных активными формами кислорода (сердечной аритмии, инфаркта миокарда, ишемии почки и инсульта головного мозга). // Биохимия. 2008. T. 73. Вып. 12. C. 1607-1621.
  5. Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Защитное действие ингибиторов GSK-3 и митохондриально-ориентированного антиоксиданта SkQ1 при ишемии/реоксигенации в культуре клеток почки. // Материалы II Международного молодежного медицинского Конгресса, Санкт-Петербург. 2007. C. 45-46.
  6. Morigi M., Imberti B., Zoja C. et al. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repare the kidney and improve function in acute renal failure. // J. Am. Soc. Nephrol. 2004. Vol. 5, № 7. P. 1794-1804.
  7. Kale S., Karihaloo A, Clark P.L. et al. Bone marrow stem cells contribute to repaire of the ischemically injured renal tubule. // J. Clin. Invest. 2003. Vol. 112. № 1. P. 42-49.
  8. Togel F., Hu Z., Weiss K. Et al. Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanism // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2005. Vol.289, N 1. P. F31-F42.
  9. Humphries B.D., Bonventre J.V. Mesenchymal stem cells in acute kidney injury. // Annu. Rev. Med. 2008. Vol. 59. P. 11-25.
  10. Baud L., Haymann J.P., Bellocq A., Founquerav B. Contribution of stem cells to renal repair after ischemia/reperfusion. // Bull. Acad. Natl. Med. 2005. Vol. 189. № 4. P. 643-644.
  11. Мусина Р.А., Бекчанова Е.С., Сухих Г.Т. Сравнение мезенхимальных клеток, полученных из различных тканей человека. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. № 2. C. 89-94.
  12. Даренков А.Ф., Яненко Э.К., Казаченко А.В., Борисик В.И. Эффективность противоишемической защиты почки пентоксифиллином и а-токоферолом. // В сб. Экспериментальная урология и нефрология. Общие проблемы патологии. М. 1996. C. 153-163.
  13. Казаченко А.В. Диагностика и профилактика ишемического повреждения почек при оперативном лечении коралловидного нефролитиаза (экспериментально-клиническое исследование). / Дисс. канд. мед. наук. М. 1996.