Одним из наиболее эффективных подходов для быстрого и точного определения характеристик клеток, их органелл, состояния цитоплазматической оболочки, оценки мембранных антигенов и многих других клеточных параметров является проточная цитофлуориметрия. Данная технология базируется на современных цитохимических флуоресцентных методах исследования и отличается высокой производительностью, позволяющей оперировать большими выборками, гарантирующими статистическую достоверность результатов. Флуоресцентные красители, проникающие в клетки, также можно использовать для дифференциации живых и мертвых клеток. Одним из подобных красителей, который принято использовать для данных целей, является иодид пропидия [1-3].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью работы было изучение возможности применения проточной цитометрии для оценки состояния сперматозоидов и ее сопоставление с результатами общепринятых методов, используемых в андрологии, в частности с методом микроскопии.

Как известно, часть сперматозоидов в процессе дифференцировки подвергается апоптозу, который на ранних стадиях характеризуется активацией эндонуклеаз, расщеплением ДНК, протеолитической деградацией ядерной оболочки, а на завершающей стадии процесса наблюдается нарушение проницаемости клеточной мембраны с последующей деструкцией клетки [4-6].

Одним из критериев оценки качества эякулята, рекомендованных ВОЗ, является подсчет процента жизнеспособных сперматозоидов, точнее, тех из них, клеточная мембрана которых непроницаема для витальных красителей, в частности для эозина. Краситель, добавленный к сперматозоидам, проникает в клетки с поврежденной мембраной и окрашивает их, затем производится подсчет окрашенных клеток в общей популяции сперматозоидов с помощью световой микроскопии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании были использованы эякуляты 43 человек: 12 - здоровых мужчин, 20 - больных с варикоцеле и 11 - с хроническим простатитом. Возраст пациентов колебался от 18 до 45 лет. Получение и исследование эякулята, а также проницаемость мембраны сперматозоидов для эозина осуществляли по рекомендациям ВОЗ 4-го издания [7]. Использовали 1%-й водный раствор эозина (ЭО) с дальнейшей оценкой процента окрашенных сперматозоидов под световым микроскопом с увеличением 400 х, а также подсчетом не менее 200 клеток.

Для исследования жизнеспособности половых клеток с помощью проточного цитометра Cоulter Epics XL (USA, Florida) применяли метод, разработанный фирмой Molecular Probes, предполагающий использование двух флуорохромов: пропидия иодид (ПИ) и сибра-14 (СИ-14), испускающих свет в различных областях спектра и регистрируемых разными каналами. ПИ проникает только в клетки с поврежденной мембраной и окрашивает их ДНК (красная флуоресценция). СИ-14 способен проникать также и через неповрежденную мембрану, окрашивая нуклеиновые кислоты всех сперматозоидов (зеленая флюоресценция). При инкубации эякулята с обоими красителями жизнеспособные клетки красятся только СИ-14, а мертвые сперматозоиды с поврежденной мембраной - обоими красителями - ПИ и СИ-14.

Образец эякулята разводили солевым буфером HEPES (1:100) и последовательно окрашивали: вначале СИ-14 в концентрации 0,02 мМ с последующей инкубацией в течение 10 минут при температуре 37°С, затем вносили ПИ в концентрации 2,4 мМ с дальнейшей десятиминутной инкубацией при той же температуре. Далее на проточном цитометре подсчитывали результаты каждого образца - 10 - 15 тысяч клеток. Для примера на рисунке 1 приведена гистограмма анализа эякулята пациента П.

Рис.1. Двухпараметрическая гистограмма распределения сперматазоидов окрашенных сибром- 14 и пробидием иодидом.
Ось абсцисс - Си 14. Ось ординат - ПИ.
2-й и 4-й квадраты - это области окрашенных сперматозоидов Си 14.
2-й квадрат Си 14+ ПИ+ - мёртвые сперматозоиды;
4-й квадрат Си 14+ ПИ- - живые сперматозоиды.
1-й и 3-й квадраты - области неокрашиваемых Си 14 сперматазоидов, предположительно включает клеточный детрит.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После разжижения эякулята проводили регламентированный анализ с определением параметров подвижности, морфологии и жизнеспособности сперматозоидов.

Результаты двух методов окрашивания свежевыделенного эякулята для выявления жизнеспособности клеток (ПИ и ЭО) были близки, процент определения нежизнеспособных сперматозоидов был равен 35,1 ± 11,75 % и 35,6 ± 9,5 % соответственно. Это позволяет рекомендовать данные методы в рутинную практику клинической андрологической лаборатории (табл. 1).

Важной проблемой андрологии и репродукции является определение жизнеспособности сперматозоидов после криоконсервации, применяемой для длительного сохранения спермы человека и животных. В связи с этим было предпринято изучение жизнеспособности сперматозоидов человека после криоконсервации вышеописанными методами. В качестве криоконсервантов применяли стерильную среду для замораживания (Sperm Freeze, Belgium), которую используют в практике вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).  

Замораживание/размораживание проводили по стандартной схеме. Определение живых/мертвых сперматозоидов осуществляли сразу после размораживания. Полученные результаты достоверно показывают более высокую выявляемость поврежденных клеток при обработке эякулята ПИ, уровень которых в два раза превосходил исходный. С целью изучения влияния оксидативного стресса, создаваемого в клетке активными формами кислорода (АФК), включая перекись водорода, на жизнеспособность сперматозоидов и повреждающее действие на мембрану клетки, были предприняты опыты с добавлением разных концентраций перекиси водорода (1,5% и 3%) в среду со сперматозоидами. Уровень повреждения мембраны сперматозоидов определяли обоими методами. Так как результаты воздействия двух концентраций перекиси водорода на сперматозоиды были сопоставимы, мы объединили их в одну группу. Как следует из полученных результатов, окрашивание сперматозоидов ПИ выявляет существенно более высокий процент поврежденных клеток, а ЭО в этих случаях менее пригоден для выявления жизнеспособности сперматозоидов.

Возможной причиной расхождения результатов оценки проницаемости клеточной мембраны, окрашенной ПИ или ЭО, могло, по нашему мнению, явиться преобладание разных форм клеточной гибели: в свежевыделенном эякуляте нежизнеспособные клетки - это, в первую очередь, сперматозоиды на поздней стадии апоптоза, а криоконсервация и воздействие перекиси водорода приводит к появлению значительного количества сперматозоидов, претерпевающих некротическую стадию гибели клетки. В этом случае, по-видимому, более чувствительным и предпочтительным является флуоресцентный метод.

ВЫВОДЫ

1. Проведённое исследование показало, что оба изучаемых метода оценки жизнеспособности сперматазоидов (проточная цитофлуориметрия и световая микроскопия с окраской эозином) дают аналогичные результаты и являются взаимозаменяемыми.
2. Окраске эозином недостаточно адекватно отражает уровень повреждения мембраны сперматозоидов при различных воздействиях на эякулят.
3. После определенных воздействий на эякулят in vitro (длительное хранение, криоконсервация, обработка перекисью водорода) цитофлуориметрический метод выявляет достоверно более высокий процент сперматозоидов с поврежденной мембраной.

Ключевые слова: проточная цитометрия, микроскопия, методы окрашивания сперматозоидов, иодид пропидия, эозин, оценка жизнеспособности сперматозоидов.

Keywords: flow cytometry, microscopy, staining methods of sperm, iodit propidium, eozin, assessment of sperm viability.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абубакиров А.Н. Повреждение ДНК сперматозоидов и мужское бесплодие. // Урология - 2009. - № 3. - C. 86 - 90.
2. Долгов В.В., Луговская С.А., Фанченко Н.Д., Миронова И.И., Назарова Е.К., Ракова Н.Г., Раков С.С., Селиванов Т.О., Щелоков А.М.. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. М., 2006. 144 с.
3. Falzone N., Huyser C., Franken D.R. Comprason between propidium iodide and 7-amino-actinomicyn-D for viability assessment during flow cytometric analyses of the human sperm acrosome. // Andrologia, 2010. Vol. 42, № 1. P. 20-26. 10. Tarozzi N., Bizzaro D., Flamigni C., Borini A. Clinical relevance of sperm DNA damage. // Reprod Biomed, 2007. Vol. 14, N 6.
   P. 746 - 757.
4. Комарова М.В. Характеристика эякулята в оценке репродуктивных возможностей человека: Автореф. канд. биол. наук. Уфа, 2000. 19 с.
5. Шеина Ю.И., Еремеев А.В., Зайцева Т.А. и др. Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов у пациентов с бесплодием. // Тез. докладов XXI межд. конф. РАРЧ. СПб., 2012. - C. 134.
6. Darzynkiewicz Z., Juan G., Li X., Gorczyca W., Murakami T., Traganos F. Cytometry in cell necrobiology: analysis of apoptosis and accidental cell death ( necrosis ). // Cytometry, 1997. Vol. 27, N 1. P. 1 - 20.
7. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. 4-е изд. М., 2001. 144 c.