При нарушении работы почек возникает целый ряд патологических изменений в функциях человеческого организма, сопровождающихся накоплением в организме больных целого ряда эндогенных и экзогенных субстанций (уремических токсинов), которые способны внести дисбаланс в нормальную работу различных органов и систем. Повышение концентрации этих соединений происходит, как правило, за счет уменьшения их почечного клиренса [1, 2, 3].

3-карбокси-4-метил-5-пропил2-фуранпропионовая кислота (фуранкарбоксиловая кислота, КМПФ, CMPF) (рис.1) – эндогенный метаболит фурановых жирных кислот в организме человека, входящих в состав пищевых фосфолипидов, был обнаружен в моче человека в 1979 году [4], а затем выделен из крови человека и идентифицирован [5].

Рис.1. Cтруктура КМПФ с молекулярной массой 240 г/моль

Было установлено, что КМПФ накапливается в крови при уремии и оказывает ингибирующее воздействие на функцию митохондриального дыхания, имеет высокую степень сродства к альбумину и за счет этого тормозит связывание с ним других веществ. Снижение скорости синтеза белков при терминальной ХПН способствует этому процессу и приводит к тому, что молярное соотношение КМПФ и альбумина может достигать 1:1. Это дает возможность КМПФ заблокировать все области связывания токсинов на альбумине, в результате они остаются в кровотоке в свободном состоянии и оказывают отравляющее воздействие на организм [6].

Ряд авторов считают, что накопление КМПФ вызывает целый ряд патологических состояний, включая анемию [7, 8]; C.F. Lim и соавт. описали нарушение функции щитовидной железы [9]; M.G. Costigan и соав. отметили поражение центральной нервной системы из-за блокады транспорта органических ионов через гемато-энцефалический барьер [10]. Кроме того, это соединение активно вмешивается в процессы выведения лекарственных веществ и тормозит их метаболизм на первой (О-деметилирования) и второй фазах (глютатион-конъюгирования и глюкуронидирования) [11]. Установлено, что оно влияет на метаболизм дигоксина за счет блокады его захвата гепатоцитами [12].

В последнее время появились данные о том, что КМПФ замедляет процессы активной тубулярной секреции [13]. Показано, что этот уремический токсин накапливается в почечной паренхиме и обладает выраженным прооксидантным эффектом, что приводит к разрушению клеток почечной паренхимы за счет гиперпродукции O2[14]. Это вещество усиливает рабдомиолизис, вызванный статинами, при терминальной стадии ХПН [15].

Механизмы накопления КМПФ в организме были изучены в фундаментальной работе Y. Tsutsumi и соавт [16]. В опытах на крысах провели изучение фармакокинетики и накопления в органах КМПФ, индоксил сульфата, индолуксусной кислоты и парааминогиппуровой кислоты. Кроме того, исследовали влияния парааминогиппуровой кислоты и тетраэтиламмония на захват КМПФ тканямии кортикального слоя почки. В опытах на кусочках почки, вырезанных из кортикального слоя почки крысы, было продемонстрировано, что имеется взаимное торможение захвата между парааминогиппуровой кислотой и КМПФ. Показано, что альфа-кетоглютарат стимулировал захват КМПФ. Было установлено, что КМПФ очень медленно выводится из организма путем уринарной экскреции с активной тубулярной секрецией. На основании опытов захвата КМПФ кусочками паренхимы почки было высказано предположение, что в этом процессе принимает участие анион/дикарбоксилатный переносчик. Кинетика КМПФ характеризовалась очень низкими показателями почечного и билиарного клиренса свободного соединения (14,3±0,6 и 0,09±0,01 мл/мин /кг, соответственно). Отмечалась высокая степень накопления соединения в почечной паренхиме: величина Ct/Cp≥ 0,9.

Согласно классическому определению, данному S. Mastry) описанному в работе J. Bergstrom и соавт.), к уремическим токсинам относятся:

• химически идентифицированные структуры, присутствующие в биологических жидкостях и поддающиеся количественному и качественному определению:
• содержание этих веществ в крови и тканях у уремических больных должно во много раз превышать такие же концентрации у здоровых людей;
• высокое содержание этих веществ в организме должно коррелировать с тяжестью уремических симптомов;
• токсический эффект этих субстанций в диапазонах концентраций, определяемых в тканях уремического больного, должен быть подтвержден в опытах на лабораторных животных и в опытах in vitro;
• концентрации, используемые в экспериментах, должны соответствовать таковым у больных с хронической почечной недостаточностью [17].

КМПФ удовлетворяет всем этим требованиям и её можно отнести к классическим уремическим токсинам.

К сожалению, среди всех уремических токсинов до последнего времени наименьшее внимание уделялось токсинам, связанным с белком, которые не выводятся во время стандартного гемодиализа. Кроме того, считалось, что связь с белком не позволяет реализовать токсический эффект этих соединений, так как он обусловлен только свободной фракцией. Работы последних лет показали наличие токсических свойств уремических токсинов и в связанном с белком состоянии [18].

Были начаты исследования по разработке методов выведения этих веществ. Удаление КМПФ является чрезвычайно сложной задачей, так как токсин практически на 100% связан с альбумином и его нужно вытеснять с белка или удалять вместе с ним. Оказалось, что проведение гемодиализа на диализаторе BK-F c мембраной на основе полиметилметакрилата, которая пропускает белок, позволяет снизить концентрацию КМПФ, и это сопровождается повышением содержания гемоглобина [19]. Проведение в течение 6-ти месяцев предилюционной гемодиафильтрации также уменьшает содержание КМПФ [20]. Перитонеальный диализ эффективно снижает концентрацию этого соединения в крови [21].

Задача удаления уремических токсинов из организма больного требует создания универсальных методов их определения. В последнее время стали разрабатываться хромато-масс-спектрометрические методики, позволяющие с большой точностью и чувствительностью одномоментно определять большое количество токсинов [22]. Это касается и метода детекции КМПФ, который требуется для разработки метода ее выведения.

Удаление указанного нефротоксина необходимо для приостановки прогрессирования почечной недостаточности. Считают, что это является одной из проблем лечения больных с ХПН [23].

Впервые накопление КМПФ в крови при уремии показали в 1984 году A. Liebich и соавт. [24]. В 1987 году N. Takeda и соавт. провели определение этого вещества в депротенизированной нагреванием сыворотке больных с терминальной ХПН хромато-массспектрофотометрическим методом. Концентрация этого вещества оказалась равной 38,6±11,4 мг/л [25].

В работе G. Lessafer и соавт. было показано, что до гемодиализа содержание КМПФ в сыворотке больных с ХПН составляло 1,97 мг±1,03 мг/л, через 240 минут диализа после коррекции на гемоконцентрацию – 2,25±1,3 мг/л [26]. В работе T. Niwa и соавт. эта величина была 41±18,3 мкг/мл до диализа и 48,4±21,3 мкг/мл – после [27]. Тогда как в работе N. Meert и соавт. она составила 0,49 (0,26-0,77) мг/дл до гемодиализа и 0,48 (0,33-0,88) мг/дл – после него [16].

Различие по количественному содержанию в крови КМПФ у различных исследователей связано не только с разной чувствительностью и специфичностью применяемых методов, но и с различным состоянием водного и белкового баланса у больных с терминальной ХПН.

Кроме того, комбинированная лекарственная терапия может привести к вытеснению КМПФ с белка и выведению из организма во время гемодиализа. В связи с этим целью исследования стала разработка современного масс-спектрометрического метода количественного определения КМПФ и определение ее содержания в крови у больных на гемодиализе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования и реактивы. Образец исследуемого вещества – 3c a r b ox y 4 -me t hy l 5 pr o py l 2 furanpropionic acid (фуранкарбоксиловая кислота) получено от компании CAYMAN CHEMICAL COMPANY (Cat 10007133 Lot 0417135-3 (500ug).

Для анализа методом ультраэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией были использованы бидистиллированная вода (Milli-Q, Millipore Advantage A10, Франция), ацетонитрил (HPLC-gradient grade, Panreac, Испания). Остальные реактивы были приобретены в Aldrich, Sigma, Acros, Lancaster (класс чистоты не ниже «химически чистый»).

Количественное определение в сыворотке крови. В пластиковую пробирку емкостью 1,5 мл помещали 500 мкл образца сыворотки крови, добавляли 1 мл ацетонитрила, тщательно перемешивали и центрифугировали 20 мин при 14000 об/мин. Отбирали 750 мкл супернатанта в пластиковую пробирку вместимостью 1.5 мл, добавляли 250 мкл воды, тщательно перемешивали, переносили в хроматографическую виалу и делали необходимое количество инжекций. В качестве стандарта использовали раствор КМПФ в 50% этаноле с концентрацией 100 нг/мл.

Хроматографирование проводили на на системе из ультраэффективного жидкостного хроматографа и тандемного масс-спектрометра, состоящей из хроматографа Acquity (Waters, США) и тандемного квадрупольного МС-детектора TQD (Waters, США). Типичная хроматограмма CMPF представлена на рис. 2.

Анализу подвергали 11,2 мкл (полная петля) разбавленного раствора образца на колонке 0,21 x 5,0 см Acquity BEH C18 (1,7 мкм) при 35оС и скорости потока 0,5 мл/мин с использованием следующих элюентов: А – 20 мМ раствор муравьиной кислоты в воде и В – 20 мМ раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле по градиентной программе: 50100% В (1 мин), 100-50% В (0,1 мин), 50-50% В (0,9 мин). Основные параметры МС-детектора: режим электрораспыления: позитивный (ES+); рабочий режим: мониторинг реакций заданных ионов (MRM); температура источника ионов: 120°С; температура испарения: 450°С; напряжение на конусе: 20 В; напряжение на капилляре: 3,0 кВ; скорость потока газа столкновений (аргон): 0,18 мл/мин; переходы сканирования: 223,28>71,04 с энергией столкновения 32 эВ, 223,28>139,08 с 22 эВ и 223,28>188,16 с 10 эВ.

Рис.2. УЭЖХ-хроматограмма (ультра эффективная жидкостная хроматография) образца после стандартной пробоподготовки, полученная MRM-методом (реакции заданных ионов)

Рис.3. Спектры в режиме регистрации позитивных ионов и спектр фрагментации иона 223

На рис. 3 А приведен массспектр вещества КМПФ, содержащий молекулярный ион [М+Н]+ с отношением массы к заряду 223, полученный при электроспрей-ионизации в режиме регистрации позитивных ионов. Спектр фрагментации молекулярного иона 223 при соударении с атомами аргона с энергией 22 эВ приведен на рис 3 Б.

Сбор и обработку данных проводили с помощью программы MassLynks (Waters, США). Концентрацию CMPF рассчитывали исходя из отношения площади пика на хроматоргамме испытуемого раствора к площади пика на хроматограмме стандарта с учетом разбавления при пробоподготовке и концентрации вещества в растворе стандарта.

Линейность соблюдалась до концентрации в крови 20 мкг/мл, предел количественного определения (LOQ) составил 0,2 мкг/мл в крови, предел обнаружения (LOD)– 0,05 мкг/мл, что сопоставимо с такими же показателями, полученными на таком же оборудововании при определении уремических токсинов, включая КМПФ, в 2012 году Y. Itoh и соавт. [20] и в 2013 году J. Boelaert и соавт. [26].

В качестве иллюстрации возможности метода и выяснения концентрационного диапазона КМПФ у больных с терминальной ХПН и здоровых лиц была изучена ее концентрация у 12 больных с хронической болезнью почек 5D стадии, находившихся в отделении сосудистой хирургии и пересадки почек на стандартном гемодиализе и 11 больных без почечной патологии. Концентрация КМПФ у людей без патологии почек была 0,098 ±0,029 мкг/мл у больных с терминальной ХПН она составляла 2,38±1,5мкг/мл, что согласуется с данными полученными в 2009 году N. Meert и соавт. [18].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработан хромато-масс-спектрометрический метод определения КМПФ с пределом количественного определения 0,2 мкг/мл крови и пределом обнаружения 0.,05 мкг/мл. Установлено, что этот уремический токсин накапливается в крови больных с терминальной ХПН.

ЛИТЕРАТУРА

1. Синюхин В.Н, Е.А. Стецюк, С.В. Арзуманов. Роль связанных с белком уремических токсинов в патогенезе хронической почечной недостаточности. //Экспериментальная и клиническая урология. 2013. N 1. С.30-34
2. Сивков А.В, Синюхин В.Н, Арзуманов С.В, Стецюк Е.А, Коробова Т.А.Уремические токсины в крови больных с терминальной стадией почечной недостаточности при дисбиозе кишечника. //Экспериментальная и клиническая урология. 2014. N 2.С.94-97
3. Niwa T. Organic acids and the uremic syndrome: protein metabolite hypothesisin the progression of chronic renal failure. //Semin Nephrol. 1996. Vol.16, N 6. P. 167–168Spiteller M, Spiteller G. Separation and characterization of acidic urine constituents (author’s translation). // J Chromatogr. 1979. Vol.164, N 3. P. 253–317
4. .Pfordt J, Thoma H, Spiteller G. Identifizierung, strukuturableitung und synthese bisher unbekannte urofuransauren im menschlichen bult. // Liebigs Ann Chem. 2006 .Vol. 181, N 12. P.2298–2308 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jlac.198119811217/pdf
5. Niwa T, Takeda N, Maeda K, Shibata M, Tatematsu A. Accumulation of furancarboxylic acids in uremic serum as inhibitors of drug binding. // Clin Chim Acta. 1988. Vol.173, N 2. P.127–138.
6. Sakai T, Takadate A, Otagiri M. Characterization of binding site of uremic toxins on human serum albumin. // Biol Pharm Bull. 1995. Vol. 18, N 12. P.1755–1761.
7. Costigan MG, Yaqoob M, Lindup WE. Effects of haemodialysis and continuous ambulatory peritoneal dialysis on the plasma clearance of an albuminbound furan dicarboxylic acid.// Nephrol Dial Transplant. 1995. Vol.10, N 5. P.648–652.
8. Lim CF, Bernard BF, de Jong M, Docter R, Krenning EP, Hennemann G. A furan fatty acid and indoxyl sulfate are the putative inhibitors of thyroxine hepatocyte transport in uremia. // J Clin Endocrinol Metab. 1993. Vol.76, N 2. P.318–324
9. Costigan MG, Callaghan CA, Lindup WE. Hypothesis: is accumulation of a furan dicarboxylic acid (3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acid) related to the neurological abnormalities in patients with renal failure? // Nephron. 1996. Vol. 73, N 2.P. 169–173.
10. Walters R, Nicholls P, Lindup WE. Effect of three toxins on various pathways of hepatic drug metabolism in vitro. // J Pharm Pharmacol. 1995. Vol. 47. P.1091-1092
11. Tsujimoto M, Kinoshita Y, Hirata S, Otagiri M, Ohtani H, Sawada Y. Effects of uremic serum and uremic toxins on hepatic uptake of digoxin. // Ther Drug Monit. 2008. Vol.30, N 5. P.576-582
12. Henderson SJ, Lindup WE. Renal organic acid transport: uptake by rat kidney slices of a furan dicarboxylic acid which inhibits plasma protein binding of acidic ligands in uremia. // J Pharmacol Exp Ther.1992. Vol.263, N 1. P.54–60.
13. Yohei M, Yasunori Iwao, Katsumi Mera, Hiroshi Watanabe, Daisuke Kadowaki, Yu Ishima , Victor Tuan Giam Chuang , Keizo Sato, Masaki Otagiri, Toru Maruyama. A uremic toxin, 3-carboxy4-methyl-5-propyl-2-furanpropionate induces cell damage to proximal tubular cells via the generation of a radical intermediate. // Biochemical Pharmacol..2012 .Vol. 84, N 9. P. 1207-1214
14. Uchiyama H, Tsujimoto M, Shinmoto T, Ogino H, Oda T, Yoshida T, Furukubo T, Izumi S, Yamakawa T, Tachiki H, Minegaki T, Nishiguchi K. Uremic Toxins Enhance Statin-Induced Cytotoxicity in Differentiated Human Rhabdomyosarcoma Cells. // Toxins. 2014. Vol.6, N 9. P, P.2612-2625.
15. Tsutsumi Y, Deguchi T, Takano M, Takadate A, Lindup WE, Otagiri M. Renal Disposition of a Furan Dicarboxylic Acid and OtherUremic Toxins in the Rat. // J Pharmacol Exp Ther. 2002. Vol. 303, N 2. P.880–887
16. Bergstrom J, Furst P. Uremic toxins. // Kidney Int Suppl. 1978. Vol. 8. P. 9-12.
17. Jourde-Chiche N, Dou L, Cerini C, Dignat-George F,Vanholder R, Brunet P. Protein-bound toxins— update 2009. // Semin Dial. 2009. Vol.22, N 4. P.334-339.
18. Niwa T. Removal of protein-bound uraemic toxins by haemodialysis. // Blood Purif. 2013.Vol.35. Suppl 2. P.20-25.
19. Meert N, Beerenhout Ch, Schepers E, GlorieuxG, Kooman J,Vanholder R. Evolution of proteinbound uraemic solutes during predilution haemofiltration. // J Nephrol. 2009. Vol. 22, N 3. P. 352357
20. Niwa T, Yazawa T, Kodama T, Uehara Y, Maeda K, Yamada K. Efficient Removal of AlbuminBound Furancarboxylic Acid, an Inhibitor of Erythropoiesis, by Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis.// Nephron. 1990. Vol. 56, N 3. P.241-245
21. Itoh Y, Ezawa A, Kikuchi K, Tsuruta Y, Niwa T. Protein-bound uremic toxins in hemodialysis patients measured by liquid chromatography/tandem mass spectrometry and their effects on endothelial ROS production.// Anal Bioanal Chem. 2012. Vol. 403, N 7. P.1841-1850.
22. Niwa T. Update of uremic toxin research by mass spectrometry. // Mass Spectrom Rev. 2011. Vol.30, N 3 P.510-521.
23. 23. Liebich AM, Pickert A,Tetachner B. Gaschromatographic and gaschromatografic-massspectrophotometric analysis of organic acids in plasma of patients with chronic renal failure.// J Chromatogr. 1984. Vol. 289. P.356-359
24. Takeda N, NiwaT, Tatematsu A, Suzuld M. Identification and quantification of protein bound ligand in uremic serum. // 1987.Clin Chem. 1987. Vol.33, N 5. P.682-685
25. Lesaffer G, De Smet R, Lameire N, Dhondt A, Duym P, Vanholder R. Intradialytic removal of protein-bound uraemic toxins: role of solute characteristics and of dialyser membrane. // Nephrol Dial Transplant. 2000. Vol.15, N 1.P.50-57
26. Niwa T, Yazawa T, Kodama T, Uehara Y, Maeda K, Yamada K. Efficient removal of albumin-bound furancarboxylic acid, an inhibitor of erythropoiesis, by continuous ambulatory peritoneal dialysis.// Nephron.Vol. 1990. Vol. 56, N 3. P.241-245
27. Boelaert J, Lynen F, Glorieux G, Eloot S, Van Landschoot M, Waterloos MA, Sandra P, Vanholder R. A novel UPLC-MS-MS method for simultaneous determination of seven uremic retention toxins with cardiovascular relevance in chronic kidney disease patients. // Anal Bioanal Chem. 2013. Vol.405. N 6. P. 1937-1947