Особенности индукции апоптоза в культуре лимфоцитов периферической крови больных с различными формами острого пиелонефрита

 В прогнозе развития острого пиелонефрита и течения системной воспалительной реакции большое значение отведено изучению состояния иммунной системы макроорганизма гуморального и клеточного иммунного ответа [1, 2].

Изучение разных субпопуляций лимфоцитов, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и апоптоза клеток крови может дать важную информацию для определения тактики ведения пациентов с острым пиелонефритом и системным воспалительным ответом [3, 4].

Известно, что сила и качество иммунного ответа макроорганизма зависят от соотношения процессов апоптоза и пролиферации клеток. Возникновение многих тяжелых заболеваний связывают с нарушением программированной клеточной гибели. В последние годы выделяют несколько ее типов: это апоптоз, аутофагическая гибель и запрограммированный некроз. Значительное усиление активационного апоптоза можно охарактеризовать как тенденцию к развитию иммунодефицитного состояния, являющегося следствием воспалительного процесса [5, 6]. В настоящее время считают, что тип дисрегуляции процесса смерти клеток крови предопределяет характер развития воспалительного процесса, его исход и терапевтическую тактику ведения больного [7]. Установлено, что ускорение процесса апоптоза лимфоцитов является основной причиной иммуносупрессии при септическом состоянии [8]. Апоптоз Т-лимфоцитов при септическом шоке превосходит таковой при сепсисе. Этот процесс сопровождается уменьшением синтеза интерлейкина-2 без изменения секреции гамма-интерферона и TNF-альфа. Скорость апоптоза коррелирует с уровнем интерлейкина 6 и экспрессией на лимфоцитах каспазы 9 [9]. Считается, что усиление апоптоза связано с дисбалансом процесса ко-стимуляции Т-клеток, клеточной гипоксией, в результате возникает нарушение функции митохондрий, от которых зависит функция и жизнеспособность клетки [10]. Увеличивается содержание ШБ1-альфа (гипоксия индуцируемый фактор)-ядерного фактора транскрипции, что является отражением провоспалительного профиля и дисфункции лимфоцитов [11]. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что необходимо изучение апоптоза лимфоцитов в клеточных культурах без влияния различных факторов макроорганизма. Это позволит оценить их жизнеспособность на фоне различной выраженности воспалительного процесса.

Отсутствие исследований апоптоза лимфоцитов периферической крови больных с острыми формами пиелонефрита послужило причиной к проведению научных исследований в этом направлении [3, 5].

Мы поставили перед собой задачу исследовать апоптоз лимфоцитов в культурах клеток здоровых и больных с различными формами острого пиелонефрита.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование было включено 28 пациентов с острым инфекционнов о спалительным пр оцессом в ерхних мочевых путей. С острым гнойнодеструктивным процессом было 12 больных и с неосложненным пиелонефритом 16 . Контрольную группу составили 14 здоровых доноров. Средний возраст во всех группах составлял 45 ± 5,4 лет. Пациентам, включенным в исследование, проведена оценка апоптоза лимфоцитов в культуре клеток. Выделение лимфоцитов крови проводили по стандартной методике в градиенте плотности фиколл-верографина. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 ммоля L-глютамина и бактериостатической концентрации гентамицина(20 мг) в СО2 инкубаторе при 37°С. Процент апоптоза оценивали через 24, 48 и 72 часа инкубации. Все культуры клеток исследовали в 4 вариантах: контрольная культура, культура с ФГА (фитогемагглютинином), дексаметазоном, с ФГА и дексаметазоном. Индуктором апоптоза служил дексаметазон (Sigma США) в концентрации 10-3 моль. В качестве активатора лимфоцитов использовался ФГА (Difco США) в концентрации 10 мкг/мл. Апоптоз оценивали на проточном цитофлюориметре «Coulter EPICS XL» по программе «Simulset», используя двойное окрашивание клеток аннексином Y-FITZ и пропидий йодидом. Такой метод позволяет различать 3 категории клеток:

1. связывающих только аннексин (А+П), что соответствует ранней стадии апоптоза, когда не нарушена клеточная мембрана;
2. меченые анексином и пропидием (А+П+) поздняя стадия, которая наступает при дефекте клеточной мембраны;
3. живые неокрашенные клетки (А-П).

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Statistica 5.11.

Анализ апоптоза лимфоцитов в культурах клеток здоровых доноров (ЗД), I группа. В свежевыделенной популяции лимфоцитов апоптоз А+ Псоставлял 5%. В процессе инкубации этот показатель возрастал со скоростью, которая зависела от варианта культивирования. Данные приведены на рисунке 1-А, из которого видно, что в контрольной культуре процентное содержание клеток А+Ппосле небольшого подъема до 11% оставался стабильным до 72 часов.

Добавление в культуру ФГА вызывало в течение 24-48 часов значительный подъем уровня апоптоза, втрое превышающий контроль.

В культурах с дексаметазоном индукция апоптоза была выражена не столь значительно, достигая к 48 часам 15%.

Уровень клеток А+Пзанимал промежуточное значение в культуре, содержащей оба индуктора.

Анализ лимфоцитов в культурах больных гнойно-деструктивным пиелонефритом (ОГП), II группа. Уровень апоптоза свежевыделенных лимфоцитов этой группы больных составлял 18%. В процессе инкубации наблюдался значительный рост количества вступающих в апоптоз клеток в контрольных культурах, т.е. без индукторов апоптоза. В культуре с ФГА наблюдалось очень резкое повышение процентного содержания клеток периферической крови, вступивших в апоптоз, который достигал 50% к концу культивирования.

Добавление дексаметазона не привело к дополнительному росту апоптоза клеток крови по сравнению с лимфоцитами контрольной культуры.

Таблица 1. Соотношение содержания в культурах лимфоцитов поздней и ранней стадии апоптоза (индекс П+/П)

Таблица 2. Достоверность различия по непараметрическому критерию Манна-Уитни между коэффициентом накопления некротических клеток разных групп исследуемых пациентов

Культура ФГА + дексаметазон практически не отличалась от культуры с ФГА (рисунок 1Б).

Анализ культур больных острым неосложненным пиелонефритом (ОП), III группа. Данные, приведенные на рисунке 1В, свидетельствуют, что культуры клеток больных этой группы, в частности контрольная и с дексаметазоном, полностью повторяют данные, полученные на клетках здоровых людей. В культурах с добавлением ФГА существенного подъема уровня апоптоза не наблюдалось, по крайней мере, до 48 часов.

Итак, при исследовании крови здоровых доноров и больных пиелонефритом было выявлено:

1. гнойные осложнения сопровождались достоверным повышением содержания апоптотических клеток среди свежевыделенных лимфоцитов периферической крови;
2. культивирование лимфоцитов выявило существенные отличия в нарастании количества апоптотических клеток, определяемое как условиями культивирования, так и тяжестью заболевания. При гнойных осложнениях уровень их был намного выше, чем у здоровых людей. Это наблюдалось при всех вариантах культивирования. У больных с острым пиелонефритом с неосложненным течением инфекционновоспалительного процесса уровень апоптоза лимфоцитов в культурах достоверно не отличался от нормы.

В литературе можно найти немало сообщений, посвященных изменению чувствительности к апоптозу лимфоцитов в культуре in vitro при различной патологии. Так, в работе Е.Р. Черных [3] исследовали апоптоз периферических Т-лимфоцитов у хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями. Было обнаружено повышение апоптоза как среди свежевыделенных лимфоцитов, так и среди культивированных 24 часа мононуклеарных клеток крови в контрольной культуре без стимуляции апоптоза. То же самое наблюдали и в присутствии анти СД3 моноклональных антител.

В.Д. Шаповалов [2] сообщает о повышении чувствительности к индукции апоптоза лимфоидных клеток при хронических поражениях пародонта.

В отечественной и зарубежной литературе имеются сообщения о повышении апоптогенной готовности лимфоцитов периферической крови больных системной красной волчанкой при культивировании in vitro [4].

P. Meier [5] обнаружил резкую активацию апоптоза в культуре Т лимфоцитов крови больных с хроническом почечной недостаточностью как в присутствии ФГА, так и без стимуляции в контрольных культурах.

Таким образом, данные об изменении чувствительности к апоптозу лимфоцитов, выявляемые при культивировании, при различных заболеваниях подтверждаются многими исследователями.

В работах, посвященных изучению апоптоза в клинической практике, как правило, учитывается только стадия раннего апоптоза А+П, поскольку, используя проточную цитометрию, лишь на этой стадии можно отличить апоптотические клетки от некротических. Известно, что in vivo апоптозные клетки распадаются на апоптозные тельца, минуя фазу повреждения клеточной оболочки, и весь процесс длится не более 3 часов. В культуре процесс дезинтеграции апоптозных клеток длится, видимо, дольше, включает фазу нарушения проницаемости клеточной мембраны, называемую поздней стадией апоптоза А+П+. В культуре таких клеток будет тем больше, чем дольше длится их полный распад. Кроме того, несомненно, что часть лимфоцитов крови в культуре гибнет путем некроза. При этом отек и нарушение проницаемости клеточной оболочки достаточно ранние события, влекущие за собой проникновение в клетку пропидия и анексина, что дает возможность количественно оценивать наличие некротических клеток А+П+. Относительно названия, информативной ценности и источника клеток А+П+ в культуре у исследователей нет единого мнения. В ряде работ эти клетки считают поздней стадией апоптоза. В других называют некротическими, полагая, что дезинтеграция клеток после нарушения целостности клеточной мембраны при апоптозе и некрозе in vitro мало чем отличаются, и оценить вклад того и другого процесса на этой стадии методом проточной цитометрии невозможно.

Рисунок 2. Суммарное содержание % лимфоцитов на ранней и поздней стадии апоптоза ( А+Пнижняя часть , А+П+ верхняя часть каждого столбца) в культуре клеток

Учитывая вышесказанное, мы попытались проанализировать накопление в культурах клеток А+П+. Отмечена некая закономерность: часто культуры с низким уровнем клеток А+Пимели высокий процент А+П+ и наоборот (рисунок 2А, 2Б, 2В). Для сравнения и анализа этих данных для всех культур было вычислено соотношение А+П+/ А+П(индекс П+/П) в культуре клеток здоровых людей, культуре клеток больных острым гнойным пиелонефритом и культуре клеток больных острым неосложненным пиелонефритом (таблица 1).

Культуры клеток здоровых людей. Из данных, представленных на рисунке 2А и в таблице 1, видно, что в контрольных культурах здоровых людей уже к окончанию первых суток превалируют клетки на стадии А+П+, (П+/П=1,3), далее их количество продолжает нарастать, превышая фазу А+Пв полтора-два раза (П+/П= 2,0 и 1,6 к 48 и 72 час. инкубации).

При добавлении в культуры ФГА наблюдалась иная ситуация: быстро нарастало количество клеток ранней фазы А+П, к 48 часам их было более 40%, а количество клеток в поздней фазе А+П+ отставало на протяжении всего периода инкубации (П+/Пвезде меньше 1.)

В культурах с дексаметазоном при умеренной активации апоптоза (10-11%) наблюдалось значительное накопление клеток на стадии А+П+, их количество к исходу 72 часов почти вчетверо превышало процентное содержание апоптозных клеток крови в ранней стадии (П+/Пк 24 часам = 2; к 72час. = 3,8.) А в культурах, содержащих и ФГА, и дексаметазон, эти показатели имели промежуточные значения.

Культуры лимфоцитов больных гнойно-деструктиным пиелонефритом. В контрольных культурах лимфоцитов этих больных, как было отмечено выше, во все сроки инкубации уровень раннего апоптоза А+Пбыл повышенным. По сравнению с ним содержание клеток поздней фазы было гораздо ниже: индекс П+/Псоставлял 0,30,6 (рисунок 2Б и таблица 1). В культурах с ФГА наблюдалась аналогичная картина: высокая активация апоптоза (А+Пболее 40 %) в сочетании с умеренным увеличением А+П+; индекс П+/Псоставлял 0,6-0,7.

В культурах с дексаметазоном активация апоптоза клеток крови такая же, как в контрольных культурах больных этой группы, а уровень А+П+ был выше: индекс П+/Пв поздние сроки составлял 1,5. В соответствующей культуре здоровых доноров этот показатель достигал величины 3,8.

Культуры клеток больных острым неосложненным пиелонефритом. Уровень ранней фазы апоптоза (А+П) в целом по всем культурам не отличался от соответствующих значений у здоровых людей (10-11%), но наблюдалась явная тенденция снижения содержания клеток А+П+ и, соответственно, показателя П+/Ппо сравнению с культурами клеток здоровых людей. Из таблицы 2 видно, что это снижение достоверно для культур с дексаметазоном. Подтверждение тому, что добавление дексметазона в культуру лимфоцитов крови здоровых людей вызывает накопление клеток в стадии А+П+, мы обнаружили в работе Vermes (1995). В ней приведены гистограммы с данными обо всех категориях клеток, определяемых при подсчете на проточном цитометре, из которых видно, что в контрольных культурах лимфоцитов здоровых людей через 72 часа апоптоз А+П= 5,5%, а А+П+ = 7,5%, т.е. П+/П= 1,3. При добавлении дексаметазона в культурах того же срока А+П= 7,0, а А+П+ = 18, т.е. П+/П= 2,6 данные близки к нашим.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При инкубировании лимфоцитов периферической крови здоровых людей и больных пиелонефритом были обнаружены отличия не только по критерию уровня апоптоза клеток стадии А+П, общепринятому в работах такого рода, но и по уровню А+П+.

Оказалось, что содержание в культуре клеток на стадии А+П+ и их соотношение с ранней фазой апоптоза подчиняется определенным закономерностям, которые, по нашим данным, определялись, с одной стороны, индуктором апоптоза, а с другой тяжестью воспалительного процесса обследованных больных.

Ключевые слова: острый пиелонефрит, острый гнойный пиелонефрит, апоптоз лимфоцитов. Keywords: scute pyelonephritis, acute purulent pyelonephritis, lymphocyte apoptosis.

ЛИТЕРАТУРА

1. Боровкова И.В., Хватов В.Б., Александрова И.В., Рей С.И., Линский М.Е., Авакумов М.М. Апоптоз мононуклеарных клеток и мертвых лейкоцитов в венозной крови септических больных // Вестник российской академии медицинских наук. 2009. № 8. С. 33-36.
2. Шаповалов В.Д. Апоптоз в патогенезе хронических воспалительных заболеваний пародонта // Иммунология. 2001. №.5. С.50-51.
3. Черных Е.Р., Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.Л., Хонина Н.А., Останин А.Л. Апоптоз и анергия периферических Т-лимфоцитов при гнойно-септической патологии //Медицинская иммунология. 1999. Т.1, № 5. С.45-51.
4. Забежинская О.М. Повреждение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой и другими аутоиммунными заболеваниями как маркер апоптогенной готовности // Вопросы биол. медицины и фармац. химии. 2002. № 3. С. 24-28.
5. Meier P., Dayer E., Blanc E., Wauters J.P. Early T cell activation correlates with expression of apoptosis markers in patients with endstage renal desease //J. Am. Soc. Nephrol. 2002. Vol.13. № 1. P. 204-212.
6. Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphotidylserine expression on early apoptosis cell using fluorescein labeled Annexin Y // J. Immunological methods. 1995, Vol. 184. P. 39-51.
7. Вantel H., Shultze-Osthoff K. Cell death in sepsis matter of how, when, where// Critical care. 2009. Vol. 13, № 4. P.173-174.
8. Hotchkiss R.S., Coopersmith C.M , Karl I.T. Prevention of lymphocytes apoptosis-a potential treatment of sepsis? // Clin. Inf. Dis. 2005. Vol.15. № 41, Suppl. 7. P 465-464.
9. Delogue G., Famulako G., Tellan G., Mandozola M., Antomecci F., Signore M.,Marcellini S., Moretti S. Lymphocyte apoptosis, caspase activation and inflammatory response in septic shock // Infection. 2008. Vol. 36, № 5. P.485-487.
10. Roger P.M., Hyvernat H., Breitmayer T.P., Dellamonica J., Bernardin J., Bernard A. Enchanced T-cell apoptosis in human septic shock is associated with alteration of costimulatory pathways // Eur. J.Clin. Inf. Dis. 2010. Vol. 28, № 6. P. 575-578.
11. Roguiera T., Andersen M., Dajafarezadeh S. Vitochondrial desfunction during sepsis, impact and possible regulating role of hypoxia inducible factor 1-alfa // Med. Intensive. 2009. Vol. 33. № 8. P.385-392.
12. Darzynkiewicz Z., Juan G., Li X., Gorczyca W., Murakami T., Traganos F. Cytometry in Cell Necrobiology: Analysis of Apoptosis and Accidental cell Death (Necrosis) // Cytometry. 1997. Vol. 27, № 1. P.1-20.