ВВЕДЕНИЕ

Мужское бесплодие, ассоциированное с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов, является значимой проблемой репродуктивной медицины [1, 2]. Далеко не всегда коррекция модифицируемых факторов мужского бесплодия, а также антиоксидантная терапия приводит к нормализации показателей целостности генетического материала [3–6]. Одним из перспективных методов преодоления бесплодия, ассоциированного с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов, является терапия рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) [5, 6].

ФСГ — основной гормон, регулирующий развитие и функцию мужских и женских гонад. Это гликопротеин, состоящий из двух цепей, альфа (92 аминокилоты) и бета (111 аминокислот). Гормон оказывает свое биологическое действие посредством связывания с рецептором ФСГ, относящимся к семейству семиспиральных трансмембранных G-белок-связанных рецепторов, который экспрессируется в гонадах. После связывания с рецептором ФСГ активирует цАМФ-протеинкиназу А и каскад реакций, регулирующий экспрессию генов через фосфорилирование факторов транскрипции CREB (Camp Response Element-Binding Protein). Биологическое действие ФСГ зависит от чувствительности рецепторного аппарата, на который, в свою очередь, влияет полиморфизм гена рецептора ФСГ [7, 8], а также гена, кодирующего бета-цепь гормона [9]. Таким образом, ответ на лечение с использованием ФСГ, как у женщин [10, 11] так и у мужчин [12, 13], зависит от полиморфизма этих генов.

ФСГ играет важную роль в поддержании процесса сперматогенеза [14], что было продемонстрировано в исследованиях на животных, в моделях с инактивированным геном рецептора ФСГ [15–17].

Терапия с использованием очищенного и рекомбинантного ФСГ была предложена в качестве лечения олигозооспермии у пациентов с нормогонадотропным состоянием. Ряд исследований оценивали эффективность лечения пациентов с нарушением сперматогенеза, в частности олигозооспермии. Несмотря на то, что многие из этих исследований показали увеличение концентрации и подвижности сперматозоидов на фоне лечения, эффективность терапии с применением ФСГ остается предметом дискуссии [12, 18, 19]. Еще более неоднозначными остаются данные об эффекте лечения тератозооспермии препаратами ФСГ [20–27].

Противоречивые результаты этих исследований по всей видимости вызваны гетерогенностью исследуемых групп по критериям включения (базальный уровень ФСГ, генотипы бета цепи ФСГ и рецептора ФСГ), дозировке и продолжительности лечения препаратом ФСГ.

Несмотря на это, Кокрановский метаанализ, включавший только рандомизированные плацебо-контролированные исследования, показал увеличение частоты беременности и живорождения при планировании беременности натуральным путем в парах с мужским фактором бесплодия на фоне терапии препаратами ФСГ, его влияния на эффективность экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) выявлено не было [25].

В недавнем метаанализе 15 исследований, включавшем 614 мужчин, которым проводилась терапия ФСГ, и 661 пациентов, принимавших плацебо или не получавших лечения, также показано увеличение частоты беременности при ее планировании натуральным путем, а также после применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), вне зависимости от методики [26]. Одиннадцать исследований, включенных в этот метаанализ, также показали увеличение концентрации и подвижности сперматозоидов, однако статистически значимой корреляции между частотой беременности и этими показателями спермограммы выявлено не было. Таким образом, увеличение частоты беременности, наблюдавшееся в этих исследованиях, вызвано не положительным влиянием терапии ФСГ на стандартные показатели качества эякулята. Вероятно, такой эффект терапии ФСГ обусловлен влиянием на другие функциональные характеристики сперматозоидов [28].

E. Casamonti с соавт. было показано, что лечение с использованием ФСГ приводит к увеличению процента сперматозоидов, способных связываться с гиалуроновой кислотой [29]. Способность к связыванию с гиалуроновой кислотой говорит о зрелости сперматозоидов [30]. Таким образом, исследование, проведенное E. Casamonti и соавт., говорит об улучшении тестикулярной функции у пациентов на фоне терапии ФСГ, что отражается в повышении содержания зрелых сперматозоидов [29].

Незрелость хроматина сперматозоидов может быть также причиной повышения уязвимости генетического материала сперматозоидов для окислительного стресса. По этой причине терапия ФСГ может быть эффективным средством лечения мужского бесплодия, ассоциированного с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов.

С целью систематизации имеющихся публикаций по данной проблеме нами был подготовлен данный обзор литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведены поиск, анализ и систематизация публикаций в базах данных PubMed, eLibrary.ru, Clinicaltrials.gov с использованием ключевых слов «мужское бесплодие» («male infertility»), «фрагментация ДНК сперматозоидов» («sperm DNA fragmentation»), «лечение» («treatment»), «фолликуллостимулирующий гормон» («follicle stimutating hormone»), «ФСГ» («FSH»). В результате было отобрано 76 публикаций, которые были включены в настоящий обзор литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фрагментация ДНК сперматозоидов

Основной функцией сперматозоида является доставка генетического материала в ооцит. Целостность генетического материала как сперматозоида, так и ооцита является обязательным условием нормального развития эмбриона.

Повреждение генетического материала сперматозоидов может происходить на разных уровнях мужского репродуктивного тракта. Существующие данные говорят о том, что фрагментация ДНК сперматозоидов может развиваться на уровне тестикул, придатков яичка, семявыносящего протока, а также в момент эякуляции.

Было показано что различные факторы могут приводить к повреждению генетического материала сперматозоидов, однако механизм повреждения реализуется посредством двух основных путей: индукция апоптоза, которая приводит к активации эндонуклеаз, и прямого повреждения генетического материала активными радикалами кислорода [31, 32]. Инициация процесса апоптоза происходит в процессе сперматогенеза в связи с тем, что какие-либо факторы приводят к нарушению тестикулярной функции и процесса конденсации хроматина [33, 34].

Незавершенный процесс апоптоза приводит к появлению в эякуляте сперматозоидов с маркерами клеточной гибели [35].

Несмотря на то, что свободные радикалы в небольших количествах играют важную роль в таких процессах, как капацитация, обеспечение подвижности и акросомальной реакции сперматозоидов, в случае их избыточной продукции и подавления антиоксидантной системы развивается окислительное повреждение генетического материала сперматозоидов и других клеточных структур [36, 37].

Нарушение процесса конденсации хроматина делает генетический материал сперматозоида особенно уязвимым для повреждения активными формами кислорода (АФК). Несмотря на то, что оксидативный стресс может оказывать повреждающее действие на сперматозоиды на всех этапах сперматогенеза и при их движении по репродуктивному тракту, имеющиеся данные говорят о том, что окислительное повреждение развивается в большей степени во время транспорта сперматозоидов по репродуктивному тракту, в то время как повреждение, связанное с механизмами апоптоза, развивается на этапе сперматогенеза [34].

Было показано, что большое содержание нежизнеспособных сперматозоидов в эякуляте ассоциировано с обнаружением сонографических признаков аномалии тестикул, в то время как увеличение содержания сперматозоидов с фрагментацией ДНК и высоким процентом жизнеспособности было ассоциировано с ультразвуковыми признаками воспалительного процесса в предстательной железе и семенных пузырьках [38].

Существуют также данные о том, что повреждение генетического материала может происходить в процессе инкубации эякулята, а также в ходе микроманипуляций селекции сперматозоидов при проведении процедуры ВРТ [39–42]. В последнем случае сперматозоиды с поврежденным генетическим материалом имеют высокую степень подвижности и, вероятно, фрагментация ДНК вызвана контаминацией материала тяжелыми металлами при проведении разделения клеток в градиенте плотности. По всей видимости, жизнеспособные сперматозоиды с поврежденным генетическим материалом представляют наиболее «опасную» фракцию сперматозоидов в эякуляте, так как могут участвовать в процессе фертилизации и приводить к образованию нежизнеспособных эмбрионов.

Многие исследования показали взаимосвязь высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов и снижения частоты беременности при планировании натуральным путем а также при выполнении процедур ВРТ [43–48].

Необходимо отметить, что эти исследования отличаются по ключевым характеристикам, таким как критерии включения пациентов в исследование и методы оценки целостности генетического материала сперматозоидов.

Фрагментация ДНК сперматозоидов может измеряться различными методами, среди которых наиболее распространенными являются TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick End Labeling), COMET (его также называют Single-cell gel electrophoresis), SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) и SCD (Sperm Chromatin Dispersion) [49].

Исследования сложно сравнить, так как различные методики позволяют определять различные виды повреждения генетического материала (двуцепочечные и одноцепочечные разрывы). Недавно опубликованные метаанализы показали что, именно методы TUNEL и COMET имеют наибольшее прогностическое значения в отношении частоты беременности при проведении процедур ВРТ [47, 48].

Учитывая то, что основным механизмом повреждения генетического материала сперматозоидов является оксидативный стресс и апоптоз, то и основными подходами к устранению фрагментации ДНК сперматозоидов должно быть назначение антиоксидантов и препаратов, препятствующих развитию апоптоза.

Во многих исследованиях проводилась оценка эффективности антиоксидантной терапии в лечении пациентов с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов [49–55]. Результаты большинства исследований показали протективное действие антиоксидантов в отношении повреждения генетического материала сперматозоидов [49–52]. Однако необходимо отметить, что многие из этих исследований были неконтролируемыми и имели небольшие выборки. Сравнение этих исследований также затруднено в виду разнородности исследуемых групп, состава антиоксидантной терапии, а также ее длительности.

Влияние лечения с применением ФСГ на уровень фрагментации ДНК сперматозоидов

Эффективность терапии ФСГ в лечении бесплодия, ассоциированного с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов, оценивалась в крупном метаанализе 6 исследований, включавшем данные о 383 пациентах. Его результаты показали небольшое, но статистически значимое снижение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов после 3 месяцев терапии ФСГ, однако улучшения таких показателей, как концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов, не наблюдалось [56]. Следует отметить, что исследования, входившие в метаанализ, были в значительной степени гетерогенны – как по критериям включения, так и по схемам лечения. В одном исследовании включались пациенты с олигозооспермией [57], в других двух — пациенты с олигоастенотератозооспермией [21, 58]. В исследовании, выполненном S. Palomba и соавт., включались пациенты со снижением как минимум одного показателя спермограммы [59], а в исследовании A. Garolla с соавт. – пациенты с бесплодием, вызванным любыми причинами за исключением инфекции добавочных половых желез и иммунного фактора [60].

Единственным исследованием, в котором критерием включения был уровень фрагментации ДНК сперматозоидов выше 15% было исследование, выполненное M. Simoni [12]. Интересно отметить, что M. Ruvolo и соавт. выявили значительное снижение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у пациентов, имевших более 15% сперматозоидов с поврежденным генетическим материалом [58].

N. Colacurci и соавт. представили данные многоцентрового исследования, включавшего 103 пациента, которым проводилась терапия ФСГ в течение 3 месяцев [61]. Ими было показано небольшое, но статистически значимое снижение фрагментации ДНК на фоне терапии. При этом было отмечено, что наибольший эффект отмечался у 48 пациентов, имевших уровень фрагментации ДНК сперматозоидов более 17%, а также то, что такой модифицируемый фактор образа жизни, как табакокурение, может достаточно сильно снизить эффективность лечения.

Метаанализ, выполненный D. Santi с соавт., в свою очередь, не выявил разницы в степени повреждения генетического материала между пациентами, которым проводилось терапия ФСГ, и группами сравнения [56]. Клинические исследования, включенные в метаанализ, выполненный D. Santi с соавт., были гетерогенны в отношении схем терапии, а также методик оценки повреждения генетического материала, хотя в большей части из них использовался метод TUNEL [12, 21, 57, 58, 60]. Необходимо отметить, что TUNEL является нестандартизованным методом, и даже небольшая вариация в алгоритме выполнения исследования может в значительной степени повлиять на его результаты [62, 63]. Эти факторы могут быть причиной того, что авторам данного метаанализа не удалось выявить положительного влияния терапии ФСГ на целостность генетического материала сперматозоидов, наблюдавшегося в других исследованиях.

Имеются также данные о том, что некоторые полиморфизмы гена рецептора ФСГ ассоциированы с менее выраженным ответом при проведении гормональной терапии [12, 64]. По этой причине тщательная селекция пациентов в таких исследованиях может быть ключевым фактором получения достоверных результатов.

Безусловно, необходимы крупные исследования для определения роли терапии ФСГ в лечении пациентов с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов. Такие исследования должны иметь определенные критерии включения, в частности наличие у пациентов уровня фрагментации ДНК сперматозоидов не ниже определенного порогового значения, а также исследование полиморфизма гена рецептора ФСГ.

Необходимо отметить, что, в связи с отсутствием международной стандартизации методики оценки фрагментации ДНК сперматозоидов, референсные значения зависят от конкретного метода. В настоящее время единственной возможностью определения нижнего референса для этого показателя является сравнение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у фертильных и бесплодных в каждой конкретной лаборатории с использованием определенного метода.

Механизмы влияния ФСГ на целостность генетического материала сперматозоидов

Предполагается, что в основе протективного действия, оказываемого ФСГ на целостность генетического материала сперматозоидов, лежит его ингибирующее влияние на апоптоз, а также стимуляция дозревания хроматина на уровне сперматогенного эпителия [34]. Имеющиеся данные позволяют говорить об ингибирующем действии ФСГ на уровне как женских, так и мужских гонад. Этот гормон является основным антагонистом развития апоптоза в яйцеклетках, индуцированного оксидативным стрессом [65, 66].

Было показано, что супрессия или иммунологическая нейтрализация ФСГ приводит к увеличению уровня фрагментации ДНК сперматозоидов в тестикулах [67]. Супрессия ФСГ индуцирует апоптоз в основном посредством внутренних механизмов, таких как увеличение активности каспаз в сперматогониях [68], однако другие молекулярные механизмы, посредством которых ингибирование ФСГ приводит к запуску процесса апоптоза, изучены недостаточно.

На животных моделях было выявлено, что инициации процесса апоптоза предшествовала активация протеинкиназы p38 MAPK и синтазы оксида азота [69]. Это, по всей видимости, происходит и у людей [68]. Вероятно ФСГ оказывает ингибирующее действие на апоптоз как в клетках Сертоли, так и половых клетках как до, так и после мейоза [67, 70].

S.M. Ruwanpura с соавт. было показано, что механизмы действия ФСГ на выживаемость половых клеток могут быть различными в зависимости от их типа [68]. В клетках Сертоли ФСГ оказывает ингибирующее действие на апоптоз посредством активации протеинкиназы B/AKT [71]. Эти данные говорят о том, что ФСГ может регулировать пролиферацию и развитие половых клеток как напрямую, действуя на внутриклеточные механизмы, так и опосредованно через клетки Сертоли.

Есть также данные об эффекте ФСГ на созревание сперматозоидов. B. Baccetti и соавт. сообщают об улучшении качества эякулята и ультраструктурных характеристик сперматозоидов у пациентов, имевших высокое содержание маркеров апоптоза и незрелости в половых клетках [72].

Результаты исследования, проведенного E. Casamonti и соавт., также подтверждают положительное влияние ФСГ на созревание сперматозоидов. Ими было выявлено, что ФСГ увеличивает число сперматозоидов, способных связываться с гиалуроновой кислотой [29]. Было также выявлено нарушение замещения гистонов на протамины в процессе сперматогенеза у мышей с индуцированной ФСГ депривацией посредством нокаута гена рецептора ФСГ, что приводило к нарушению конденсации хроматина [73].

От зрелости сперматозоида сильно зависит целостность его генетического материала. В процессе сперматогенеза происходит замещение гистонов на протамины, и нарушение этого процесса может приводить к повышению уязвимости генетического материала сперматозоидов для атаки активными радикалами [74, 75]. В дополнение к этому, есть данные, которые говорят о том, что нарушение упаковки хроматина также может быть триггером процесса апоптоза [34].

Необходимо также отметить, что повышение способности сперматозоидов к связыванию с гиалуроновой кислотой было ассоциировано с высокой степенью упаковки хроматина и низким уровнем фрагментации ДНК [30, 76].

Как уже было отмечено, фрагментация ДНК может быть вызвана прямым действием активных форм кислорода. Несмотря на то что данных, подтверждающих наличие антиоксидантных свойств у ФСГ в тестикулах и клетках сперматогенного эпителия, нет, исключать такие свойства этого гормона нельзя, так как было показано, что ФСГ ингибирует индуцированный оксидативным стрессом апоптоз в клетках яичников [63].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мужское бесплодие, связанное с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов, представляет значительную проблему, однако до сегодняшнего дня имеется крайне ограниченный набор эффективных методик лечения этой категории пациентов. Терапия с применением ФСГ является одним из перспективных методов лечения пациентов с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов. Однако гетерогенность опубликованных исследований не позволяет сделать однозначных выводов относительно влияния терапии ФСГ на целостность генетического материала сперматозоидов. В будущих исследованиях критериями включения должны быть строгие пороговые значения уровня фрагментации ДНК сперматозоидов, а также определенные результаты фармакогенетического исследования, определяющего категорию пациентов, у которых терапия с применением ФСГ не будет эффективной.

ЛИТЕРАТУРА

1. Коршунов М.Н., Коршунова Е.С., Кызласов П.С., Коршунов Д.М., Даренков С.П. Структурные нарушения хроматина сперматозоидов. Патофизиологические аспекты. Клиническая значимость. Вестник урологии 2021;9(1):95–104. [Korshunov M.N., Korshunova E.S., Kyzlasov P.S., Korshunov D.M., Darenkov S.P. Structural disorders of sperm chromatin. Pathophysiological aspects. clinical significance. Vestnik urologii = Urology Herold 2021;9(1):95–104. (In Russian)]. https://doi.org/10.21886/2308-6424-2021-9-1-95-104.

2. Некрасова И.Л., Шестакова В.Г., Иванов А.Г., Артамонов А.А. Исследование фрагментации ДНК сперматозоидов в диагностике мужского бесплодия. Верхневолжский медицинский журнал 2015;(3):42–44. [Nekrasova I.L., Shestakova V.G., Ivanov A.G., Artamonov A.A. Study of sperm DNA fragmentation in the diagnosis of male infertility. Verhnevolzhskij medicinskij zhurnal = Upper Volga Medical Journal 2015;(3):42–4 (In Russian)].

3. Гамидов С.И., Овчинников Р.И., Попова А.Ю., Голубева О.Н., Ушакова И.В. Роль мужчины в привычном невынашивании беременности у супруги. Урология 2016;(1 Suppl):35–43. [Gamidov S.I., Ovchinnikov R.I., Popova A.Yu., Golubeva O.N., Ushakova I.V. The role of a man in the habitual miscarriage of a wife. Urologiya = Urologiia 2016;(1 Suppl):35–43. (In Russian)].

4. Метелев А.Ю., Богданов А.Б., Ивкин Е.В., Митрохин А. А., Воднева М. М., Велиев Е.И. и др. Эффективность гипербарической оксигенации в коррекции уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин с идиопатическим бесплодием. Экспериментальная и клиническая урология 2015;(3):49–54. [Metelev A.Yu., Bogdanov A.B., Ivkin E.V., Mitrokhin A.A., Vodneva M.M., Veliyev E.I., et al. The effectiveness of hyperbaric oxygenation in correcting the level of sperm DNA fragmentation in men with idiopathic infertility. Eksperimentalnaya i klinicheskaya urologiya = Experimental and Clinical Urology 2015;(3):49–54. (In Russian)].

5. Олефир Ю.В., Коршунов М.Н., Живулько А.Р., Монаков Д.М. Лечение бесплодия, ассоциированного с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов. Экспериментальная и клиническая урология 2022;15(1):112–9. [Olefir Yu.V., Korshunov M.N., Zhivulko A.R., Monakov D.M. Treatment of infertility associated with a high level of sperm DNA fragmentation. Eksperimentalnaya i klinicheskaya urologiya = Experimental and Clinical Urology 2022;15(1):112–9. (In Russian)]. https://doi.org/10.29188/2222-8543-2022-15-1-112-119.

6. Виноградов И.В., Виноградова Л.М., Базанов П.А., Юткин Е.В. Лечение мужского бесплодия, обусловленного высокой степенью фрагментации ДНК сперматозоидов. Проблемы репродуктологии 2014;(3):67–72. [Vinogradov I.V., Vinogradova L.M., Bazanov P.A., Yutkin E.V. Treatment of male infertility caused by a high degree of sperm DNA fragmentation. Problemy reproduktologii = Problems of Reproductology 2014;(3):67–72. (In Russian)].

7. Ulloa-Aguirre A, Reiter E, Crépieux P. FSH receptor signaling: complexity of interactions and signal diversity. Endocrinology 2018;159(8):3020–35. https://doi.org/10.1210/en.2018-00452.

8. Santi D, Potì F, Simoni M, Casarini L. Pharmacogenetics of G-protein-coupled receptors variants: FSH receptor and infertility treatment. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2018;32(2):189–200. https://doi.org/10.1016/j.beem.2018.01.001.

9. Alviggi C, Conforti A, Santi D, Esteves SC, Andersen CY, Humaidan P, et al. Clinical relevance of genetic variants of gonadotrophins and their receptors in controlled ovarian stimulation: a systematic review and meta-analysis. Hum Reprod Update 2018;24(5):599–614. https://doi.org/10.1093/humupd/dmy019.

10. Perez Mayorga M, Gromoll J, Behre HM, Gassner C, Nieschlag E, Simoni M. Ovarian response to follicle-stimulating hormone (FSH) stimulation depends on the FSH receptor genotype. J Clin Endocrinol Metab 2000;85(9):3365–9. https://doi.org/10.1210/jcem.85.9.6789.

11. Behre HM, Greb RR, Mempel A, Sonntag B, Kiesel L, Kaltwasser P, et al. Significance of a common single nucleotide polymorphism in exon 10 of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor gene for the ovarian response to FSH: a pharmacogenetic approach to controlled ovarian hyperstimulation. Pharmacogenet Genomics 2005;15(7):451–6. https://doi.org/10.1097/01.fpc.0000167330.92786.5e.

12. Simoni M, Santi D, Negri L, Hoffmann I, Muratori M, Baldi E, et al. Treatment with human, recombinant FSH improves sperm DNA fragmentation in idiopathic infertile men depending on the FSH receptor polymorphism p.N680S: a pharmacogenetic study. Hum Reprod 2016;31(9):1960–9. https://doi.org/10.1093/humrep/dew167.

13. Wu Q, Zhang J, Zhu P, Jiang W, Liu S, Ni M, et al. . The susceptibility of FSHB−211G > T and FSHR G-29A, 919A > G, 2039A > G polymorphisms to men infertility: an association study and meta-analysis. BMC Med Genet 2017;18(1):81. https://doi.org/10.1186/s12881-017-0441-4.

14. Nieschlag E, Simoni M, Gromoll J, Weinbauer GF. Role of FSH in the regulation of spermatogenesis: clinical aspects. Clin Endocrinol 1999;51(2):139–46. https://doi.org/10.1046/j.1365-2265.1999.00846.x.

15. Kumar TR, Wang Y, Lu N, Matzuk MM. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nat Genet 1997;15(2):201–4. https://doi.org/10.1038/ng0297-201.

16. Abel MH, Wootton AN, Wilkins V, Huhtaniemi I, Knight PG, Charlton HM. The effect of a null mutation in the follicle-stimulating hormone receptor gene on mouse reproduction. Endocrinology 2000;141(5):1795–803. https://doi.org/10.1210/endo.141.5.7456.

17. Dierich A, Sairam MR, Monaco L, Fimia GM, Gansmuller A, LeMeur M, et al. . Impairing folliclestimulating hormone (FSH) signaling in vivo: targeted disruption of the FSH receptor leads to aberrant gametogenesis and hormonal imbalance. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(23):13612–7.

18. Kliesch S, Behre HM, Nieschlag E. Recombinant human follicle-stimulating hormone and human chorionic gonadotropin for induction of spermatogenesis in a hypogonadotropic male. Fertil Steril 1995;63(6):1326–8. https://doi.org/10.1016/S0015-0282(16)57619-5.

19. Shiraishi K, Matsuyama H. Gonadotoropin actions on spermatogenesis and hormonal therapies for spermatogenic disorders [Review]. Endocr J 2017;64(2):123–31. https://doi.org/10.1507/endocrj.EJ17-0001.

20. Baccetti B, Piomboni P, Bruni E, Capitani S, Gambera L, Moretti E, et al. Effect of follicle-stimulating hormone on sperm quality and pregnancy rate. Asian J Androl 2004;6(2):133–7.

21. Colacurci N, Monti MG, Fornaro F, Izzo G, Izzo P, Trotta C, et al. . Recombinant human FSH reduces sperm DNA fragmentation in men with idiopathic oligoasthenoteratozoospermia. J Androl 2012;33(4):588–93. https://doi.org/10.2164/jandrol.111.013326.

22. Caroppo E, Niederberger C, Vizziello GM, D'Amato G. Recombinant human follicle-stimulating hormone as a pretreatment for idiopathic oligoasthenoteratozoospermic patients undergoing intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 2003;80(6):1398–403. https://doi.org/10.1016/S0015-0282(03)02202-7.

23. Efesoy O, Cayan S, Akbay E. The efficacy of recombinant human follicle-stimulating hormone in the treatment of various types of male-factor infertility at a single university hospital. J Androl 2009;30(6):679–84. https://doi.org/10.2164/jandrol.108.007278.

24. Barbonetti A, Calogero AE, Balercia G, Garolla A, Krausz C, La Vignera S, et al. The use of follicle stimulating hormone (FSH) for the treatment of the infertile man: position statement from the Italian Society of Andrology and Sexual Medicine (SIAMS). J Endocrinol Invest 2018;41(9):1107–22. https://doi.org/10.1007/s40618-018-0843-y.

25. Attia AM, Abou-Setta AM, Al-Inany HG. Gonadotrophins for idiopathic male factor subfertility. Cochrane Database Syst Rev 2013:CD005071. https://doi.org/10.1002/14651858.CD005071.pub4.

26. Santi D, Granata AR, Simoni M. FSH treatment of male idiopathic infertility improves pregnancy rate: a meta-analysis. Endocr Connect 2015;4:R46–58. https://doi.org/10.1530/EC-15-0050.

27. Guzick DS, Overstreet JW, Factor-Litvak P, Brazil CK, Nakajima ST, Coutifaris C, et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. N Engl J Med 2001;345:1388–93. https://doi.org/10.1056/NEJMoa003005.

28. Leushuis E, van der Steeg JW, Steures P, Repping S, Bossuyt PM, Mol BW, et al. Semen analysis and prediction of natural conception. Hum Reprod 2014;29(7):1360–7. https://doi.org/10.1093/humrep/deu082.

29. Casamonti E, Vinci S, Serra E, Fino MG, Brilli S, Lotti F, et al. Short-term FSH treatment and sperm maturation: a prospective study in idiopathic infertile men. Andrology 2017;5(3):414–22. https://doi.org/10.1111/andr.12333.

30. Yagci A, Murk W, Stronk J, Huszar G. Spermatozoa bound to solid state hyaluronic acid show chromatin structure with high DNA chain integrity: an acridine orange fluorescence study. J Androl 2010;31(6):566–72. https://doi.org/10.2164/jandrol.109.008912.

31. Tamburrino L, Marchiani S, Montoya M, Elia Marino F, Natali I, Cambi M, et al. Mechanisms and clinical correlates of sperm DNA damage. Asian J Androl 2012;14(1):24–31. https://doi.org/10.1038/ aja.2011.59.

32. Rex AS, Aagaard J, Fedder J. DNA fragmentation in spermatozoa: a historical review. Andrology 2017;5(4):622–30. https://doi.org/10.1111/andr.12381.

33. Sakkas DE, Seli GC, Manicardi M, Nijs W, Ombelet D. Bizzaro: the presence of abnormal spermatozoa in the ejaculate: did apoptosis fail? Hum Fertil 2004;7(2):99–103. https://doi.org/10.1080/14647270410001720464.

34. Muratori M, Tamburrino L, Marchiani S, Cambi M, Olivito B, Azzari C, et al. Investigation on the origin of sperm DNA fragmentation: role of apoptosis, immaturity and oxidative stress. Mol Med 2015;21(1):109–22. https://doi.org/10.2119/molmed.2014.00158.

35. Sakkas D, Seli E, Bizzaro D, Tarozzi N, Manicardi GC. Abnormal spermatozoa in the ejaculate: abortive apoptosis and faulty nuclear remodelling during spermatogenesis. Reprod Biomed Online 2003;7(4):428–32. https://doi.org/10.1016/S1472-6483(10)61886-X.

36. O'Flaherty C, Matsushita-Fournier D. Reactive oxygen species and protein modifications in spermatozoa. Biol Reprod 2017;97(4):577–85. https://doi.org/10.1093/biolre/iox104.

37. Aitken RJ. Reactive oxygen species as mediators of sperm capacitation and pathological damage. Mol Reprod Dev 2017;84(10):1039–52. https://doi.org/10.1002/mrd.22871.

38. Lotti F, Tamburrino L, Marchiani S, Maseroli E, Vitale P, Forti G, et al. DNA fragmentation in two cytometric sperm populations: relationship with clinical and ultrasound characteristics of the male genital tract. Asian J Androl 2017;19(3):272–9. https://doi.org/10.4103/1008-682X.174854.

39. Muratori M, Maggi M, Spinelli S, Filimberti E, Forti G, Baldi E. Spontaneous DNA fragmentation in swim-up selected human spermatozoa during long term incubation. J Androl 2003;24(2):253–62. https://doi.org/10.1002/j.1939-4640.2003.tb02670.x.

40. Toro E, Fernández S, Colomar A, Casanovas A, Alvarez JG, López-Teijón M, et al. Processing of semen can result in increased sperm DNA fragmentation. Fertil Steril 2009;92(6):2109–12. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2009.05.059.

41. Gosálvez J, Cortés-Gutiérrez EI, Nuñez R, Fernández JL, Caballero P, López-Fernández C, et al. A dynamic assessment of sperm DNA fragmentation versus sperm viability in proven fertile human donors. Fertil Steril 2009;92(6):1915–9. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2008.08.136.

42. Zini A, Nam RK, Mak V, Phang D, Jarvi K. Influence of initial semen quality on the integrity of human sperm DNA following semen processing. Fertil Steril 2000;74(4):824–7. https://doi.org/10.1016/ S0015-0282(00)01495-3.

43. Evenson DP, Jost LK, Marshall D, Zinaman MJ, Clegg E, Purvis K, et al. . Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum Reprod 1999;14(4):1039–49. https://doi.org/10.1093/humrep/14.4.1039.

44. Giwercman A, Lindstedt L, Larsson M, Bungum M, Spano M, Levine RJ, et al. Sperm chromatin structure assay as an independent predictor of fertility in vivo: a case-control study. Int J Androl 2010;33(1):e221–7. https://doi.org/10.1111/j.1365-2605.2009.00995.x.

45. Muratori M, Marchiani S, Tamburrino L, Cambi M, Lotti F, Natali I, et al. DNA fragmentation in brighter sperm predicts male fertility independently from age and semen parameters. Fertil Steril 2015;104(3):582–90.e4. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.06.005.

46. Robinson L, Gallos ID, Conner SJ, Rajkhowa M, Miller D, Lewis S, et al. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and meta-analysis. Hum Reprod 2012;27(10):2908–17. https://doi.org/10.1093/humrep/des261.

47. Cissen M, Wely MV, Scholten I, Mansell S, Bruin JP, Mol BW, et al. Measuring sperm DNA fragmentation and clinical outcomes of medically assisted reproduction: a systematic review and meta-analysis. PLoS ONE 2016;11:e0165125. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165125.

48. Simon L, Zini A, Dyachenko A, Ciampi A, Carrell DT. A systematic review and meta-analysis to determine the effect of sperm DNA damage on in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection outcome. Asian J Androl 2017;19(1):80–90. https://doi.org/10.4103/1008-682X.182822.

49. Martínez-Soto JC, Domingo JC, Cordobilla B, Nicolás M, Fernández L, Albero P, et al. Dietary supple-mentation with docosahexaenoic acid (DHA) improves seminal an-tioxidant status and decreases sperm DNA fragmentation. System Biol Reprod Med 2016;62(6):387–95. https://doi.org/10.1080/19396368.2016.1246623.

50. Gual-Frau J, Abad C, Amengual MJ, Hannaoui N, Checa M A., Ribas-Maynou J, et al. Oral antioxidant treatment partly improves integrity of human sperm DNA in infertile grade I varicocele patients. Hum Fertil 2015;18(3):225–9. https://doi.org/10.3109/14647273.2015.1050462.

51. Jannatifar R, Parivar K, Roodbari NH, Nasr-Esfahani MH. Effects of N-acetyl-cysteine supplementation on sperm quality, chromatin integrity and level of oxidative stress in infertile men. Reprod Biol Endocrinol 2019;17(1):24. https://doi.org/10.1186/s12958-019-0468-9.

52. Гамидов С.И., Овчинников Р.И., Попова А.Ю. Двойное слепое рандомизированное плацебоконтролируемое исследование эффективности и безопасности комплекса ацетил-L-карнитина, L-карнитина фумарата и альфа-липоевой кислоты (СпермАктин® Форте) в лечении мужского бесплодия. Урология 2016;(1 Suppl):35–43. [Gamidov S.I., Ovchinnikov R.I., Popova A.Yu.. Doubleblind, randomized, placebo-controlled study of the efficacy and safety of a complex of acetyl-L-carnitine, L-carnitine fumarate and alpha-lipoic acid (SpermActin® Forte) in the treatment of male infertility. Urologiya = Urol 2016;(1 Suppl):35–43. (In Russian)].

53. Oleszczuk K, Augustinsson L, Bayat N, Giverkman, Bungum M. Prevalence of high DNA fragmentation index in male partners of unexplained infertile couples. Andrology 2013;(1):357–60. https://doi.org/10.1111/j.2047-2927.2012.00041.x.

54. Williams EA, Parker M, Robinson A, Pitt S, Pacey AA. A randomized placebo- controlled trial to investigate the effect of lactolycopene on semen quality in healthy males. Eur J Nutr 2019;59(2):825–33. https://doi.org/ 10.1007/s00394-019-02091-5.

55. Showell MG, Mackenzie-Proctor R, Brown J, Yazdani A, Stankiewicz MT, Hart RJ. Antioxidants for male subfertility. Cochrane Database Syst Rev 2014:CD007411. https://doi.org/10.1002/14651858. CD007411.pub3.

56. Santi D, Spaggiari G, Simoni M. Sperm DNA fragmentation index as a promising predictive tool for male infertility diagnosis and treatment management – meta-analyses. Reprod Biomed Online 2018;37(3):315–26. https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2018.06.023.

57. Garolla A, Selice R, Engl B, Bertoldo A, Menegazzo M, Finos L, et al. Spermatid count as a predictor of response to FSH therapy. Reprod Biomed Online 2014;29(1):102–12. https://doi.org/10.1016/ j.rbmo.2014.02.014.

58. Ruvolo G, Roccheri MC, Brucculeri AM, Longobardi S, Cittadini E, Bosco L. Lower sperm DNA fragmentation after r-FSH administration in functional hypogonadotropic hypogonadism. J Assist Reprod Genet 2013;30(4):497–503. https://doi.org/10.1007/s10815-013-9951-y.

59. Palomba S, Falbo A, Espinola S, Rocca M, Capasso S, Cappiello F, et al. Effects of highly purified follicle-stimulating hormone on sperm DNA damage in men with male idiopathic subfertility: a pilot study. J Endocrinol Invest 2011;34(10):747–52. https://doi.org/10.3275/7745.

60. Garolla A, Ghezzi M, Cosci I, Sartini B, Bottacin A, Engl B, et al. FSH treatment in infertile males candidate to assisted reproduction improved sperm DNA fragmentation and pregnancy rate. Endocrine 2017;56(2):416–25. https://doi.org/10.1007/s12020-016-1037-z.

61. Colacurci N, De Leo V, Ruvolo G, Piomboni P, Caprio F, Pivonello R, et al. Recombinant FSH improves sperm DNA damage in male infertility: a phase II clinical trial. Front Endocrinol 2018;9:383. https://doi.org/10.3389/fendo.2018.00383.

62. Muratori M, Tamburrino L, Tocci V, Costantino A, Marchiani S, Giachini C, et al. Small variations in crucial steps of TUNEL assay coupled to flow cytometry greatly affect measures of sperm DNA fragmentation. J Androl 2010;31(4):336–45. https://doi.org/10.2164/jandrol.109.008508.

63. Muratori M, Forti G, Baldi E. Comparing flow cytometry and fluorescence microscopy for analyzing human sperm DNA fragmentation by TUNEL labeling. Cytometry A 2008;73(9):785–7. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20615.

64. Ferlin A, Vinanzi C, Selice R, Garolla A, Frigo AC, Foresta C. Toward a pharmacogenetic approach to male infertility: polymorphism of follicle-stimulating hormone beta-subunit promoter. Fertil Steril 2011;96(6):1344–9. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2011.09.034.

65. Chun SY, Eisenhauer KM, Minami S, Billig H, Perlas E, Hsueh AJ. Hormonal regulation of apoptosis in early antral follicles: follicle-stimulating hormone as a major survival factor. Endocrinology 1996;137(4):1447–56. https://doi.org/10.1210/endo.137.4.8625923.

66. Tsai-Turton M, Luderer U. Opposing effects of glutathione depletion and follicle-stimulating hormone on reactive oxygen species and apoptosis in cultured preovulatory rat follicles. Endocrinology 2006;147(3):1224–36. https://doi.org/10.1210/en.2005-1281.

67. Tesarik J, Martinez F, Rienzi L, Iacobelli M, Ubaldi F, Mendoza C, et al. . In vitro effects of FSH and testosterone withdrawal on caspase activation and DNA fragmentation in different cell types of human seminiferous epithelium. Hum Reprod 2002;17(7):1811–9. https://doi.org/10.1093/humrep/17.7.1811.

68. Ruwanpura SM, McLachlan RI, Stanton PG, Meachem SJ. Follicle-stimulating hormone affects spermatogonial survival by regulating the intrinsic apoptotic pathway in adult rats. Biol Reprod 2008;78(4):705–13. https://doi.org/10.1095/biolreprod.107.065912.

69. Vera Y, Erkkilä K, Wang C, Nunez C, Kyttänen S, Lue Y, et al. Involvement of p38 mitogen-activated protein kinase and inducible nitric oxide synthase in apoptotic signaling of murine and human male germ cells after hormone deprivation. Mol Endocrinol 2006;20(7):1597–609. https://doi.org/10.1210/me.2005-0395.

70. Billig H, Furuta I, Rivier C, Tapanainen J, Parvinen M, Hsueh AJ. Apoptosis in testis germ cells: developmental changes in gonadotropin dependence and localization to selective tubule stages. Endocrinology 1995;136(1):5–12. https://doi.org/10.1210/endo.136.1.7828558.

71. Gonzalez-Robayna IJ, Falender AE, Ochsner S, Firestone GL, Richards JS. Follicle-stimulating hormone (FSH) stimulates phosphorylation and activation of protein kinase B (PKB/Akt) and serum and glucocorticoid-lnduced kinase (Sgk): evidence for A kinase-independent signaling by FSH in granulosa cells. Mol Endocrinol 2000;14(8):1283–300. https://doi.org/10.1210/mend.14.8.0500.

72. Baccetti B, Strehler E, Capitani S, Collodel G, De Santo M, Moretti E, et al. The effect of follicle stimulating hormone therapy on human sperm structure (Notulae seminologicae 11). Hum Reprod 1997;12(9):1955–68. https://doi.org/10.1093/humrep/12.9.1955.

73. Krishnamurthy H, Danilovich N, Morales CR, Sairam MR. Qualitative and quantitative decline in spermatogenesis of the follicle-stimulating hormone receptor knockout (FORKO) mouse. Biol Reprod 2000;62(5):1146–59. https://doi.org/10.1095/biolreprod62.5.1146.

74. Sakkas D, Manicardi G, Bianchi PG, Bizzaro D, Bianchi U. Relationship between the presence of endogenous nicks and sperm chromatin packaging in maturing and fertilizing mouse spermatozoa. Biol Reprod 1995;52(5):1149–55. https://doi.org/10.1095/biolreprod52.5.1149.

75. Marcon L, Boissonneault G. Transient DNA strand breaks during mouse and human spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling. Biol Reprod 2004;70(4):910–8. https://doi.org/10.1095/biolreprod.103.022541.

76. Parmegiani L, Cognigni GE, Bernardi S, Troilo E, Ciampaglia W, Filicori M. «Physiologic ICSI»: hyaluronic acid (HA) favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus, resulting in improvement of embryo quality. Fertil Steril 2010;93(2):598–604. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2009.03.033.