ВВЕДЕНИЕ
Всемирная организация здравоохранения считает бесплодие важной проблемой общественного здоровья, поскольку его частота обычно колеблется от 15 до 25%. Мужской фактор в бесплодных браках составляет около 50% всех случаев, что связано по мнению многочисленных авторов с изменением характеристик микробиоты эякулята и напрямую коррелирует с изменением параметров сперматозоидов, включая количество, подвижность и морфологию [1].
Согласно статистическим исследованиям от 30% до 40% бесплодных мужчин имеют пальпируемое варикоцеле, тогда как распространенность варикоцеле в общей популяции составляет около 15% [2]. По мнению отечественных и зарубежных ученых, варикоцеле становится причиной повреждения гематотестикулярного барьера (ГТБ). Вопрос корреляции нарушений функции ГТБ и микробиологического дисбаланса у инфертильных пациентов изучен плохо и до сих пор остается предметом дискуссий и исследований. Появление секвенирования нового поколения (NGS) позволило более точно охарактеризовать микробиом человека, однако на сегодняшний день в мировом научном сообществе нет единого мнения о значимости микробиома в репродуктивном здоровье мужчин, ввиду недостаточности объема информации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
За период с 2020 по 2022 год нами проведена исследовательская работа с использованием биологического материала тестикулярной ткани, полученной путем открытой биопсии яичка, и материала мазков из уретры у инфертильных пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле. Полученный материал 11 образцов мазков из уретры и 10 образцов тестикулярной ткани был направлен для проведения метода высокопроизводительного секвенирования (NGS).
Критериям включения служили: добровольное информированное согласие пациента на участие в исследовании, возраст старше 18 лет, бесплодие в браке более 1 года при регулярной половой жизни без использования средств контрацепции, отсутствие в анамнезе двусторонних поражений яичек, их гипоплазии, онкологической патологии, а также отсутствие антибактериальной терапии в течение 3 месяцев, наличие варикоцеле, подтвержденного ультразвуковым исследованием органов мошонки с допплерометрией.
Критериями исключения были: наличие онкологической патологии, инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), генетические и эндокринные факторы бесплодия, тяжелая соматическая патология на момент обследования, регулярный прием лекарственных средств, приводящих к развитию бесплодия и гипогонадизма, повышение концентрации простатспецифического антигена в сыворотке крови более 4 нг/мл и/или его свободной фракции более 5 нг/мл, психические заболевания, хронический алкоголизм и наркомания, наличие ВИЧ-инфекции.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведения высокопроизводительного секвенирования микробиоты яичка и уретры представляли собой бактериальные пейзажи с преобладанием определенных микробных сообществ (рис. 1, 2).
Рис. 1. Таксономический состав микробиома уретры (А) и ткани яичка (Б) на уровне фил у пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле. Отображены только филы, представленность которых >1% хотя бы в одном из образцов
Fig. 1. Taxonomic composition of the microbiome of the urethra (A) and testicular tissue (B) at the level of phyla in patients with non-obstructive azoospermia and concomitant varicocele. Only phyla are displayed, the representation of which is >1% in at least one of the samples
Рис. 2. Таксономический состав микробиома уретры (А) и ткани яичка (Б) на уровне видов у пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле. Отображены только виды, представленность которых больше 5% хотя бы в одном из образцов
Fig. 2. Taxonomic composition of the microbiome of the urethra (A) and testicular tissue (B) at the species level in patients with non-obstructive azoospermia and concomitant varicocele. Only species with >5% representation in at least one of the samples are displayedкоторых >5% хотя бы в одном из образцов
Также было выявлено, что индекс альфа-разнообразия Шеннона был достоверно выше в образцах ткани яичка по сравнению с образцами мазков из уретры, у данной группы пациентов (рис. 3), что свидетельствует о более богатом и разнообразном сообществе ткани яичка.
Рис. 3 Индекс альфа-разнообразия Шеннона
Fig.3. Shannon alpha diversity index
Кроме того, был проведен корреляционный анализ представленности различных таксонов и индекса Шеннона с различными показателями (возраст, степень тяжести и результаты патогистологического исследования (ПГИ)). Так было выявлено, что возраст пациента достоверно отрицательно коррелирует с представленностью филы Firmicutes в микробиоте уретры (чем старше пациент, чем меньше Firmicutes), а концентрация (в спермограмме) положительно коррелирует с представленностью неопределенного вида рода Pseudomonas (чем выше концентрация, тем выше представленность Pseudomonas) (рис. 4).
Рис.4. Тепловая карта коэффициентов корреляции Спирмена на основе анализа микробиоты уретры, *p value<0,05 у пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле. Все корреляции, отмеченные на рисунке звездочкой, – достоверные. Синие клетки – отрицательная корреляция, красные – положительная.
Fig.4. Heat map of Spearman correlation coefficients based on urethral microbiota analysis, *p value<0.05 in patients with non-obstructive azoospermia and concomitant varicocele. All correlations marked with an asterisk in the figure are significant. Blue cells – negative correlation, red – positive
На рисунке 5 представлена тепловая карта коэффициентов корреляции Спирмена на основе анализа микробиоты яичка.
Рис. 5. Тепловая карта коэффициентов корреляции Спирмена на основе анализа микробиоты яичка, *p value<0,05 у пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле
Fig. 5. Heat map of Spearman correlation coefficients based on testicular microbiota analysis, *p value<0,05 in patients with non-obstructive azoospermia and concomitant varicocele
ОБСУЖДЕНИЕ
Варикоцеле представляет собой сосудистое заболевание, проявляющееся аномальным расширением, удлинением и извитостью вен в семенном канатике, что приводит к боли, дискомфорту и прогрессирующей дисфункции яичек. В конечном счете это ведет к развитию мужского бесплодия, лабораторные проявления которого отражаются в патологическом изменении качественных и количественных характеристик эякулята [3]. Причинно-следственная связь в отношении мужской инфертильности и варикоцеле до сих пор является предметом обсуждения в урологическом сообществе [2, 4]. Одной из причин патоспермии может быть нарушение функциональности ГТБ, который предотвращает инвазию патологически активных веществ и проникновение антигенов сперматозоидов в эпителий семенных канальцев, тем самым ингибируя аутоиммунные реакции и способствует пролиферации иммунносупрессивных агентов при воздействии негативных регуляторных факторов, включая тестикулярные макрофаги, лимфоциты, дендритные клетки и тучные клетки [5].
По мнению многих исследователей варикоцеле приводит к повреждению гематотестикулярного барьера, а также изменяет гормональную регуляцию. Ретроградный кровоток по центральной вене левого надпочечника приводит к стимуляции секреции не только кортизона, но и прогестерона и андростендиона. Прогестерон, являясь природным антиандрогеном, угнетает сперматостероидогенез. Также наблюдается поражение клеток Сертоли и дегенерация соединений со сперматидами, что в свою очередь частично блокирует выработку тестостерона, однако такая тенденция не прослеживается у мужчин без варикоцеле [6].
Нарушение функции ГТБ неоднократно доказано на экспериментальных моделях аутоиммунного орхита, где достоверно показана выраженная инфильтрация макрофагами и секреция многочисленных воспалительных факторов. Аналогичные изменения выявлены некоторыми исследователями и при варикоцеле [7, 8].
Патологическое влияние факторов иммунного ответа при варикоцеле обусловлено действием на плотные контакты клеток Сертоли в ГТБ, увеличивая его проницаемость, с последующей деградацией сперматогенного эпителия [9]. Вопрос корреляции нарушений функции ГТБ и микробиологического дисбаланса у инфертильных пациентов изучен плохо и до сих пор остается предметом дискуссий и исследований. Сложная и многогранная роль бактериальных сообществ в регуляции нормального функционирования всего организма недооценена и требует дальнейшего изучения. Бактерии мочевыводящих путей, влияя на анатомические и физиологические характеристики колонизируемых ими местных тканей, участвуют в регуляции репродуктивной системы, а именно в поддержании, сохранении и восстановлении фертильности [10-13].
Появление секвенирования нового поколения (NGS) позволило более точно охарактеризовать микробиом человека и определить наличие собственного биотопа различных топографических локаций. В ряде исследований NGS сообщалось о микробиологическом разнообразии биоматериала спермы с преобладающими видами Lactobacillus и Prevotella, где лактобациллы были связаны с улучшением параметров спермы, Prevotella, напротив, оказывает негативное влияние на качество спермы [14, 15].
На сегодняшний день в мировом научном сообществе нет единого мнения о значимости микробиома в репродуктивном здоровье мужчин, ввиду недостаточности объема информации. Однако появление геномного секвенирования уже позволило описать значительную часть человеческого микробиома, что открывает нам возможности более рациональной оценки взаимосвязи микробиологического мира с нормальным функционированием всего организма [16 – 20].
В проведенном нами исследовании микробиоты яичка и уретрального тракта, наглядно продемонстрировано, что тестикулярная ткань человека не является стерильной средой. В работе представлены новые данные о влиянии варикозного расширения вен семенного канатика на повышение проницаемости гематотестикулярного барьера, приводящее к расширению спектра микробиоты яичка, что подтверждается современными научными работами и в мировом сообществе.
ВЫВОДЫ
Метод секвенирования нового поколения (NGS) расширяет наш горизонт путем выявления в, как считалось ранее, «стерильных средах» той или иной микробиоты. Нарушение целостности ГТБ является триггером, приводящим к таксономическому разнообразию тестикулярной микробиоты. Яички инфертильных мужчин с сочетанием необструктивной азооспермии и варикоцеле имеют качественно и количественно более разнообразный таксономический спектр на уровне как филов, так и ридов, что доказывает значимость микробиоты яичка в регуляции сперматогенеза. Все это позволяет нам взглянуть на иные критерии диагностики необструктивной азооспермии на основании сведений о микробиоте яичка, полученных методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения.
