ВВЕДЕНИЕ

Всемирная организация здравоохранения считает бесплодие важной проблемой общественного здоровья, поскольку его частота обычно колеблется от 15 до 25%. Мужской фактор в бесплодных браках составляет около 50% всех случаев, что связано по мнению многочисленных авторов с изменением характеристик микробиоты эякулята и напрямую коррелирует с изменением параметров сперматозоидов, включая количество, подвижность и морфологию [1].

Согласно статистическим исследованиям от 30% до 40% бесплодных мужчин имеют пальпируемое варикоцеле, тогда как распространенность варикоцеле в общей популяции составляет около 15% [2]. По мнению отечественных и зарубежных ученых, варикоцеле становится причиной повреждения гематотестикулярного барьера (ГТБ). Вопрос корреляции нарушений функции ГТБ и микробиологического дисбаланса у инфертильных пациентов изучен плохо и до сих пор остается предметом дискуссий и исследований. Появление секвенирования нового поколения (NGS) позволило более точно охарактеризовать микробиом человека, однако на сегодняшний день в мировом научном сообществе нет единого мнения о значимости микробиома в репродуктивном здоровье мужчин, ввиду недостаточности объема информации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

За период с 2020 по 2022 год нами проведена исследовательская работа с использованием биологического материала тестикулярной ткани, полученной путем открытой биопсии яичка, и материала мазков из уретры у инфертильных пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле. Полученный материал 11 образцов мазков из уретры и 10 образцов тестикулярной ткани был направлен для проведения метода высокопроизводительного секвенирования (NGS).

Критериям включения служили: добровольное информированное согласие пациента на участие в исследовании, возраст старше 18 лет, бесплодие в браке более 1 года при регулярной половой жизни без использования средств контрацепции, отсутствие в анамнезе двусторонних поражений яичек, их гипоплазии, онкологической патологии, а также отсутствие антибактериальной терапии в течение 3 месяцев, наличие варикоцеле, подтвержденного ультразвуковым исследованием органов мошонки с допплерометрией.

Критериями исключения были: наличие онкологической патологии, инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), генетические и эндокринные факторы бесплодия, тяжелая соматическая патология на момент обследования, регулярный прием лекарственных средств, приводящих к развитию бесплодия и гипогонадизма, повышение концентрации простатспецифического антигена в сыворотке крови более 4 нг/мл и/или его свободной фракции более 5 нг/мл, психические заболевания, хронический алкоголизм и наркомания, наличие ВИЧ-инфекции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведения высокопроизводительного секвенирования микробиоты яичка и уретры представляли собой бактериальные пейзажи с преобладанием определенных микробных сообществ (рис. 1, 2).

Рис. 1. Таксономический состав микробиома уретры (А) и ткани яичка (Б) на уровне фил у пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле. Отображены только филы, представленность которых >1% хотя бы в одном из образцов
Fig. 1. Taxonomic composition of the microbiome of the urethra (A) and testicular tissue (B) at the level of phyla in patients with non-obstructive azoospermia and concomitant varicocele. Only phyla are displayed, the representation of which is >1% in at least one of the samples

Рис. 2. Таксономический состав микробиома уретры (А) и ткани яичка (Б) на уровне видов у пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле. Отображены только виды, представленность которых больше 5% хотя бы в одном из образцов
Fig. 2. Taxonomic composition of the microbiome of the urethra (A) and testicular tissue (B) at the species level in patients with non-obstructive azoospermia and concomitant varicocele. Only species with >5% representation in at least one of the samples are displayedкоторых >5% хотя бы в одном из образцов

Также было выявлено, что индекс альфа-разнообразия Шеннона был достоверно выше в образцах ткани яичка по сравнению с образцами мазков из уретры, у данной группы пациентов (рис. 3), что свидетельствует о более богатом и разнообразном сообществе ткани яичка.

Рис. 3 Индекс альфа-разнообразия Шеннона
Fig.3. Shannon alpha diversity index

Кроме того, был проведен корреляционный анализ представленности различных таксонов и индекса Шеннона с различными показателями (возраст, степень тяжести и результаты патогистологического исследования (ПГИ)). Так было выявлено, что возраст пациента достоверно отрицательно коррелирует с представленностью филы Firmicutes в микробиоте уретры (чем старше пациент, чем меньше Firmicutes), а концентрация (в спермограмме) положительно коррелирует с представленностью неопределенного вида рода Pseudomonas (чем выше концентрация, тем выше представленность Pseudomonas) (рис. 4).

Рис.4. Тепловая карта коэффициентов корреляции Спирмена на основе анализа микробиоты уретры, *p value<0,05 у пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле. Все корреляции, отмеченные на рисунке звездочкой, – достоверные. Синие клетки – отрицательная корреляция, красные – положительная.
Fig.4. Heat map of Spearman correlation coefficients based on urethral microbiota analysis, *p value<0.05 in patients with non-obstructive azoospermia and concomitant varicocele. All correlations marked with an asterisk in the figure are significant. Blue cells – negative correlation, red – positive

На рисунке 5 представлена тепловая карта коэффициентов корреляции Спирмена на основе анализа микробиоты яичка.

Рис. 5. Тепловая карта коэффициентов корреляции Спирмена на основе анализа микробиоты яичка, *p value<0,05 у пациентов с необструктивной азооспермией и сопутствующим варикоцеле
Fig. 5. Heat map of Spearman correlation coefficients based on testicular microbiota analysis, *p value<0,05 in patients with non-obstructive azoospermia and concomitant varicocele

ОБСУЖДЕНИЕ

Варикоцеле представляет собой сосудистое заболевание, проявляющееся аномальным расширением, удлинением и извитостью вен в семенном канатике, что приводит к боли, дискомфорту и прогрессирующей дисфункции яичек. В конечном счете это ведет к развитию мужского бесплодия, лабораторные проявления которого отражаются в патологическом изменении качественных и количественных характеристик эякулята [3]. Причинно-следственная связь в отношении мужской инфертильности и варикоцеле до сих пор является предметом обсуждения в урологическом сообществе [2, 4]. Одной из причин патоспермии может быть нарушение функциональности ГТБ, который предотвращает инвазию патологически активных веществ и проникновение антигенов сперматозоидов в эпителий семенных канальцев, тем самым ингибируя аутоиммунные реакции и способствует пролиферации иммунносупрессивных агентов при воздействии негативных регуляторных факторов, включая тестикулярные макрофаги, лимфоциты, дендритные клетки и тучные клетки [5].

По мнению многих исследователей варикоцеле приводит к повреждению гематотестикулярного барьера, а также изменяет гормональную регуляцию. Ретроградный кровоток по центральной вене левого надпочечника приводит к стимуляции секреции не только кортизона, но и прогестерона и андростендиона. Прогестерон, являясь природным антиандрогеном, угнетает сперматостероидогенез. Также наблюдается поражение клеток Сертоли и дегенерация соединений со сперматидами, что в свою очередь частично блокирует выработку тестостерона, однако такая тенденция не прослеживается у мужчин без варикоцеле [6].

Нарушение функции ГТБ неоднократно доказано на экспериментальных моделях аутоиммунного орхита, где достоверно показана выраженная инфильтрация макрофагами и секреция многочисленных воспалительных факторов. Аналогичные изменения выявлены некоторыми исследователями и при варикоцеле [7, 8].

Патологическое влияние факторов иммунного ответа при варикоцеле обусловлено действием на плотные контакты клеток Сертоли в ГТБ, увеличивая его проницаемость, с последующей деградацией сперматогенного эпителия [9]. Вопрос корреляции нарушений функции ГТБ и микробиологического дисбаланса у инфертильных пациентов изучен плохо и до сих пор остается предметом дискуссий и исследований. Сложная и многогранная роль бактериальных сообществ в регуляции нормального функционирования всего организма недооценена и требует дальнейшего изучения. Бактерии мочевыводящих путей, влияя на анатомические и физиологические характеристики колонизируемых ими местных тканей, участвуют в регуляции репродуктивной системы, а именно в поддержании, сохранении и восстановлении фертильности [10-13].

Появление секвенирования нового поколения (NGS) позволило более точно охарактеризовать микробиом человека и определить наличие собственного биотопа различных топографических локаций. В ряде исследований NGS сообщалось о микробиологическом разнообразии биоматериала спермы с преобладающими видами Lactobacillus и Prevotella, где лактобациллы были связаны с улучшением параметров спермы, Prevotella, напротив, оказывает негативное влияние на качество спермы [14, 15].

На сегодняшний день в мировом научном сообществе нет единого мнения о значимости микробиома в репродуктивном здоровье мужчин, ввиду недостаточности объема информации. Однако появление геномного секвенирования уже позволило описать значительную часть человеческого микробиома, что открывает нам возможности более рациональной оценки взаимосвязи микробиологического мира с нормальным функционированием всего организма [16 – 20].

В проведенном нами исследовании микробиоты яичка и уретрального тракта, наглядно продемонстрировано, что тестикулярная ткань человека не является стерильной средой. В работе представлены новые данные о влиянии варикозного расширения вен семенного канатика на повышение проницаемости гематотестикулярного барьера, приводящее к расширению спектра микробиоты яичка, что подтверждается современными научными работами и в мировом сообществе.

ВЫВОДЫ

Метод секвенирования нового поколения (NGS) расширяет наш горизонт путем выявления в, как считалось ранее, «стерильных средах» той или иной микробиоты. Нарушение целостности ГТБ является триггером, приводящим к таксономическому разнообразию тестикулярной микробиоты. Яички инфертильных мужчин с сочетанием необструктивной азооспермии и варикоцеле имеют качественно и количественно более разнообразный таксономический спектр на уровне как филов, так и ридов, что доказывает значимость микробиоты яичка в регуляции сперматогенеза. Все это позволяет нам взглянуть на иные критерии диагностики необструктивной азооспермии на основании сведений о микробиоте яичка, полученных методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Gachet C, Prat M, Burucoa C, Grivard P, Pichon M. Spermatic microbiome characteristics in infertile patients: impact on sperm count, mobility, and morphology. J Clin Med 2022;11(6):1505. https://doi.org/10.3390/jcm11061505.

2. Gupta C, Chinchole A, Shah R, Pathak H, Talreja D, Kayal A. Microscopic varicocelectomy as a treatment option for patients with severe oligospermia. Investig Clin Urol 2018;59(3):182-6. https://doi.org/ 10.4111/icu.2018.59.3.182.

3. Zhang X, Deng C, Liu W, Liu H, Zhou Y, Li Q, et al. Effects of varicocele and microsurgical varicocelectomy on the metabolites in semen. Sci Rep 2022;12(1):5179. https://doi.org/10.1038/s41598- 022-08954-y.

4. Madhusoodanan V, Patel P, Blachman-Braun R, Ramasamy R. Semen parameter improvements after microsurgical subinguinal varicocele repair are durable for more than 12 months. Can Urol Assoc J 2020;14(3):E80-E83. https://doi.org/10.5489/cuaj.6047.

5. Fang Y, Su Y, Xu J, Hu Z, Zhao K, Liu C, Zet al. Varicocele-mediated male infertility: from the perspective of testicular immunity and inflammation. Front Immunol 2021;12:729539. https://doi.org/ 10.3389/fimmu.2021.729539.

6. Горпинченко И.И., Стусь В.П.,Малышкин Д.С., Полион Н.Ю. Мужское бесплодие: этиология, патогенез, классификация, диагностика и методы лечения. Днепр: ООО «Акцент ПП», 2016. 344 с. [Gorpinchenko I.I., Stus V.P., Malyshkin D.S., Polion N.Yu. Male infertility: etiology, pathogenesis, classification, diagnosis and treatment methods. Dnipro: Accent PP, 2016. 344 p. (In Russian)].

7. Gerdprasert O, O'Bryan MK, Muir JA, Caldwell AM, Schlatt S, de Kretser DM, et al. The response of testicular leukocytes to lipopolysaccharide-induced inflammation: further evidence for heterogeneity of the testicular macrophage population. Cell Tissue Res 2002;308(2):277–85. https://doi.org/10.1007/s00441-002-0547-6.

8. Райцина С.С., Курносов А.В., Яровая И.М., Гладкова Н.С., Давыдова А.И. Аутоиммунная природа нарушений сперматогенеза в моделях варикоцеле у крыс. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1979;87(1):44–8. [Raitsina S.S., Kurnosov A.V., Yarovaya I.M., Gladkova N.S., Davydova A.I. Autoimmune nature of spermatogenesis disorders in rat varicocele models. Byulleten eksperimentalnoy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine 1979;87(1):44–8. (In Russian)].

9. Zhang H, Yin Y, Wang G, Liu Z, Liu L, Sun F. Interleukin-6 disrupts blood-testis barrier through inhibiting protein degradation or activating phosphorylated ERK in Sertoli cells. Sci Rep 2014;4:4260. https://doi.org/10.1038/srep04260

10. Santacroce L, Imbimbo C, Ballini A, Crocetto F, Scacco S, Cantore S, et al. Testicular immunity and its connection with the microbiota. Physiological and clinical implications in the light of personalized medicine. J Pers Med 2022;12(8):1335. https://doi.org/10.3390/jpm12081335

11. Willey J., Sherwood L., Woolverton C. Prescott's Microbiology (9th ed.). 2013; New York: McGraw Hill. P. 713–21.

12. Pasolli E, Asnicar F, Manara S, Zolfo M, Karcher N, Armanini F, et al. Extensive unexplored human microbiome diversity revealed by over 150,000 genomes from metagenomes spanning age, geography and lifestyle. Cell 2019;176 (3):649-62. https://doi.org/ 10.1016/j.cell.2019.01.001

13. Ventimiglia E, Pozzi E, Capogrosso P, Boeri L, Alfano M, Cazzaniga W, et al. Extensive assessment of underlying etiological factors in primary infertile men reduces the proportion of men with idiopathic infertility. Front Endocrinol 2021;12:801125. https://doi.org/ 10.3389/fendo.2021.801125.

14. Farahani L, Tharakan T, Yap T, Ramsay JW, Jayasena CN, Minhas S. The semen microbiome and its impact on sperm function and male fertility: A systematic review and meta-analysis. Andrology 2021;9(1):115-44. https://doi.org/ 10.1111/andr.12886..

15. Lundy SD, Sangwan N, Parekh NV, Selvam MKP, Gupta S, McCaffrey P, et al. Functional and taxonomic dysbiosis of the gut, urine, and semen microbiomes in male infertility. Eur Urol 2021;79(6):826-36. https://doi.org/ 10.1016/j.eururo.2021.01.014.

16. Boitrelle F, Shah R, Saleh R, Henkel R, Kandil H, Chung E, et al. The Sixth edition of the WHO manual for human semen analysis: a critical review and SWOT analysis. Life (Basel) 2021;11(12):1368. https://doi.org/10.3390/life11121368.

17. Doroftei B, Ilie OD, Dabuleanu AM, Hutanu D, Vaduva CC. A retrospective narrative minireview regarding the seminal microbiota in infertile male. Medicina 2022;58(8):1067. https://doi.org/ 10.3390/medicina58081067.

18. Quigley E.M. Gut bacteria in health and disease. Gastroenterol Hepatol 2013;9(9):560–9.

19. Alfano M, Ferrarese R, Locatelli I, Ventimiglia E, Ippolito S, Gallina P, et al. Testicular microbiome in azoospermic men-first evidence of the impact of an altered microenvironment. Hum Reprod 2018;33(7):1212-7. https://doi.org/10.1093/humrep/dey116.

20. Chen H, Luo T, Chen T, Wang G. Seminal bacterial composition in patients with obstructive and non-obstructive azoospermia. Exp Ther Med 2018;15(3):2884-90. https://doi.org/10.3892/etm.2018.5778.