Российская тест-система РСА3: первые результаты

Сидоренков А.В., Говоров А.В., Пушкарь Д.Ю., Павлов К. А., Шкопоров А.Н., Хохлова Е.В., Корчагина А.А., Григорьев М.Э., Чехонин В.П.

Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний у мужчин. На сегодняшний день РПЖ занимает второе место среди причин смерти от злокачественных заболеваний у мужчин в Европе и в Северной Америке. В Рос сии отмечается неуклонный рост числа больных с впервые установленным диагнозом РПЖ: за послед ние 10 лет заболеваемость РПЖ на 100 000 населения возросла на 120,5% [1]. В последние годы в результате активного внедрения в клиническую практику определения уровня про статического специфического анти гена (ПСА), новых методов диагностики и скрининга РПЖ наблюдается тенденция к успешному лечению и мониторированию РПЖ. В свою очередь, средний возраст больных с впервые выявленным заболеванием существенно снизился, что повлекло за собой увеличение процента вы явления ранних форм РПЖ (Т1-2) [2, 3].

К базовым методам диагностики и скрининга рака предстательной железы относится, прежде всего, пальцевое ректальное исследование (ПРИ), определение в сыворотке крови уровня ПСА, трансректальное ультра звуковое исследование (ТРУЗИ) с последующим выполнением биопсии предстательной железы (ПЖ) [4, 5].

С началом «эры ПСА» этот метод за рекомендовал себя как наиболее точный в диагностике, стадировании и осуществления динамического мониторинга РПЖ. Многими исследованиями показано, что у мужчин с уровнем ПСА от 4 до 10 нг/мл РПЖ диагностируется только у каждого четвертого, а частота негативных биопсий составляет 70-80%. Извест но также, что ПСА – это не раково специфический маркер, а всего лишь органоспецифический, и его повышение может быть обусловлено дру гими заболеваниями ПЖ (добро качественная гиперплазия предстательной железы, острый или хронический простатит) или различными манипуляциями на ПЖ (ПРИ, мас саж, ТРУЗИ, эякуляция, острая за держка мочи, недавно перенесенная биопсия или другая операция на ПЖ и др.) [3, 6].

«Золотым стандартом» диаг ностики РПЖ в настоящее время является мультифокальная биопсия ПЖ под ультразвуковым контролем. Показаниями к биопсии являются повышенный уровень ПСА, данные ПРИ и обнаружение гипоэхогенных зон в ткани ПЖ по данным ТРУЗИ [7]. В 1989 г. Hodge K. разработана и предложена ставшая в дальнейшем общепринятой методика выполне ния биопсии ПЖ из 6 точек (так на зываемая «секстантная» биопсия), которая показала улучшение вы являемости РПЖ [8]. При этом число ложно-отрицательных биопсий составляло по разным данным от 31,5% до 45%) [7, 9, 10]. Guichard G. et al. сообщили, что частота обнару жения рака при 21-, 18-, 12и 6-то чечной биопсии составляет 42,5%, 41,5%, 38,7% и 31,7% соответ ственно[11]. Наиболее сложной задачей сегодня является определение показаний для выполнения повтор ной биопсии ПЖ при первичной «не гативной». Оптимальный срок проведения повторной биопсии не установлен. Его определяют на осно вании результатов патоморфологического исследования первичной биопсии с учетом риска выявления РПЖ (высокий или быстро расту щий уровень ПСА, изменения по данным ПРИ, отягощенный семей ный анамнез) [12].

С каждым годом появляется все больше новых онкомаркеров, в том числе и биомаркеров РПЖ. Это обусловлено, прежде всего, разви тием науки, нанотехнологий, моле кулярной биологии и генетики. К наиболее многообещающим и из ученным маркерам относятся [-2] proPSA (незрелая форма ПСА или предшественник), PSCA (антиген простатических стволовых клеток), PSP 94 (секретируемый белок пред стательной железы 94), ECPA и ECPA-2 (ранние антигены РПЖ), uPA/uPAR (рецепторы активатора плазминогена урокиназы), GSTP1 (глутатион-S-трансфераза Р1), TM PRESS2:ERG (химерный белок, обра зующийся при хромосомной мута ции со слиянием генов TMPRESS2 и ERG), РСА3 (специфический анти ген рака ПЖ 3) [13].

Одним из наиболее перспективных среди предложенных методов ранней неинвазивной диагностики РПЖ являются тест-системы, основанные на количественном анализе РНК-продукта гена PCA3, овер экспрессия которого наблюдается при малигнизации тканей предстательной железы. Ген PCA3 был от крыт в конце 1990-х гг. в ходе сравнения транскриптомов нормальных и злокачественных тканей предстательной железы. Дальнейшие исследования показали, что высокий уровень экспрессии PCA3 строго специфичен для злокачественных опухолей ПЖ и её метастазов, но не для любых нормальных тканей, а также доброкачественных или злока чественных опухолей другого генеза. На основании этих данных было вы сказано предположение о возможно сти использования уровня экcпрессии гена PCA3 в качестве биомар кера РПЖ [14]. PCA3 был открыт в конце 1990-х годов в ходе совмест ной работы двух исследовательских групп из Университета Рэдбаунд и госпиталя Джона Хопкинса. Сравнив транскриптомы нормальных и злокачественных тканей предстательной железы с помощью диффе ренциального дисплея (DD), они обнаружили мРНК, уровень экс прессии которой в раковых клетках ПЖ более чем в 60 раз превышал уровень экспрессии в нормальных клетках предстательной железы. мРНК получила название DD3 (от англ. differential display clone 3), а позже PCA3 (от англ. prostate cancer antigen 3). Marion Bussemakers счита ется основоположником и первооткрывателем гена DD3 [14]. На сегодняшний день предложено 3 по коления таких систем диагностики, основанных на определении содер жания мРНК гена PCA3 в моче или её клеточном осадке. Полученное значение нормируют на число клеток ПЖ в анализируемом образце, опре деляемое, в свою очередь, по количе ству мРНК гена KLK3, кодирующего белок ПСА и экспрессирующегося исключительно в тканях предста тельной железы [15, 16]. Существующие системы диагностики РПЖ, основанные на количественном ана лизе уровня экспрессии PCA3, раз личаются по типу исследуемого материала и по способу оценки коли чества мРНК PCA3. В первой предложенной тест-системе суммарную клеточную РНК выделяют из клеточ ного осадка мочи, собранного цен трифугированием. Полученную РНК используют для реакции обратной транскрипции и последующей поли меразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Затем количество мРНК гена PCA3 и ПСА определяют методом гибридизации продуктов ОТ-ПЦР на специ альных микрочипах. Эта система диагностики была апробирована в Голландии в ходе исследования, в котором приняло участие 108 пациентов. Одновременно с анализом экспрессии РСА3 в данной группе об следованных проводили гистологическое исследование биоптатов ПЖ. Исследование показало, что высокий уровень PCA3 в клеточном осадке мочи коррелирует с высоким риском обнаружения РПЖ результатам био псии [17]. Метод диагностики рака предстательной железы, разработан ный компанией DiagnoCure Inc. (Ка нада) в 2004 году, основан на определении уровня экспрессии PCA3 и ПСА в клеточном осадке с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального вре мени (ОТ-ПЦР-РВ). В ходе проведенного мультицентрового исследова ния 517 пациентов было показано, что выявление высокого уровня РСА3 в моче пациента коррелирует с ростом вероятности обнаружения рака пред стательной железы; показана высокая специфичность и чувствительность теста [18, 19].

В ноябре 2003 компания Gen Probe Inc.(Сан-Диего) получила от DiagnoCure эксклюзивные права на диагностику PСA3 по всему миру. Gen-Probe вскоре разработала количественный анализ PCA3 третьего поколения – Progensa®. Отличительной чертой данного теста является определение уровня экспрессии гена PCA3 не в клеточном осадке, а непо средственно в первой порции мочи после массажа ПЖ. Все дальнейшие биохимические процессы также про водятся в той же пробирке, куда пер воначально собиралась исследуемая моча. В ходе проведенных в 2006 2008 гг. мультицентровых исследова ний у 1343 пациентов, Deras IL. et al., Groskopf J. et al., Haese A. et al. и Marks LS. et al. [20, 21, 22, 23] установили до статочно убедительную корреляцию между оверэкспрессией РСА3 и РПЖ с чувствительностью теста 57% и спе цифичностью 74,52%. Эта система диагностики в 2007 г. была также апробирована в Голландии, в ходе исследования, в котором приняли участие 534 пациента c уровнем ПСА 3-15 нг/мл. Одновременно с определением уровня экспрессии мРНК гена РСА3 проводили гистологическое исследование ткани ПЖ. Исследование показало, что высокий уровень PCA3 в клеточном осадке мочи коррелирует с высоким риском обнаружения РПЖ по ре зультатам биопсии [24].

Достоверно установлено, что уровень РСА3 является предиктором обнаружения злокачественной опухоли ПЖ при первичной, либо повторной биопсии [20, 22]. РСА3 показал способность быть независи мым предиктором РПЖ, использо вание которого возможно в комплексе с другими факторами риска РПЖ (возраст, уровень общего ПСА, данные ПРИ, объем ПЖ, результаты патогистологического заключения и т.д.). Van Gils MP. et al. в 2008 году высказали предположение, что значение индекса РСА3 может быть ассоциировано с более агрессивным раком. Эта теория предполагает, что клетки агрессивных форм РПЖ изначально более инвазивны и могут легко проходить в просвет канальцев желез, особенно после паль цевого ректального исследования [25]. В некоторых публикациях авторы также описывают корреляцию между уровнем индекса РСА3 и бал лами по системе градации Глисона [22], что, в свою очередь, противоре чит данным других публикаций, в которых говорится об отсутствии та ких закономерностей [25]. Auprich M. et al. описали клиническую ценность РСА3 как предиктора агрессивности РПЖ, что может иметь значение при планировании радикальной проста тэктомии. Некоторыми авторами сделаны выводы о корреляции между уровнем РСА3 и объемом опухолевого поражения ПЖ по дан ным патогистологического исследования после радикальной простат эктомии, прогностической ценности корреляции баллов РСА3 и клини чески незначимого РПЖ [22, 26]. Van Poppel H. et al. в 2012 году в своей публикации описали значи тельное превышение РСА3 в группе больных со стадией T3a-T3b по сравнению с группой больных, пере несших РПЭ, со стадией T2a-T2c [27]. Существующие данные различных публикаций о ценности уровня РСА3 в прогнозировании экстракапсулярного распространения опухоли противоре чивы [22, 26].

Учитывая тот факт, что PCA3 является важным независимым предиктором результатов биопсии, РСА3 был включен в современные предоперационные номограммы. На сегодня доступно в последних пуб ликациях 5 подобных номограмм, в двух из которых номограммы построены без учета анамнеза предше ствующих биопсий ПЖ – это PCPT (Prostate Cancer Prevention Trial) калькулятор риска и графические номограммы, опубликованные 2009 году Chun F.K. et al. [28]. Wu AK. et al. в 2012 году в своей номо грамме определили показания для повторной биопсии ПЖ для пациен тов с одной «негативной» биопсией в анамнезе [29]. Кроме РСА3 в номо грамме учитывается уровень общего ПСА, PSAD (плотность ПСА), дан ные ПРИ и ТРУЗИ. В 2013 г. Hansen J. et al. опубликовали данные своего исследования с построением номо граммы для первичной биопсии, ко торая превосходила клинические модели без PCA3 (р< 0,001). Диагностическая точность увеличилась на 4,5-7,1%, что было связанно включением PCA3. Авторы сделали вывод, что данная номограмма поз волит избежать до 55% так называе мых«ненужных» биопсий предстательной железы [30]. Ruffion А. et al. создали номограмму на основании РСА3 для определения показаний к первичной биопсии ПЖ. У пациентов с индексом PCA3≥35 отмечался более высокий риск положи тельных биопсий: 66% против 31% (р< 0,001); аналогично, риск был значительно выше при использова нии порогового значения индекса РСА3 в 21 балл: 62% против 22% (р< 0,001)[31].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработать отечественную ди агностическую тест-систему PCA3 с низкой затратной стоимостью для ранней неинвазивной диагностики РПЖ, основанной на количествен ной детекции мРНК гена PCA3 мето дом обратной транскрипции поли меразно-цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), а также разработать рекомендации по применению и использованию теста PCA3 в клинической практике.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В клинике урологии МГМСУ имени А.И. Евдокимова в 2012 и 2013 гг. проведён набор биомате риала у 169 пациентов, которые про ходили лечение. Из всего собран ного материала 49 образцов были исследованы. Пациенты были разде лены на 3 группы в соответствии с поставленным диагнозом. Группа с верифицированным РПЖ составила 28 пациентов в возрасте 51–81 года клинической стадией болезни рT2аN0M0–T3вN1M0. Стадирова ние выполнялось по результатам па тогистологического исследования после радикальной простатэктомии. Группа сравнения включала 13 пациентов с ДГПЖ в возрасте 56–82 лет. В контрольную группу вошли 8 условно здоровых индивидуумов в возрасте 29–54 лет. Помимо опреде ления уровня PCA3 у пациентов с РПЖ и ДГПЖ проводили исследова ние содержания общего ПСА в сы воротке крови с использованием стандартных методов. После массажа ПЖ производился сбор 20–40 мл первой порции мочи. Исследуе мая моча (10 мл) подвергалась цен трифугированию с добавлением к клеточному осадку лизирующего бу фера. Дизайн ДНК-олигонуклеоти дов для применения в качестве праймеров и зондов в реакциях ПЦР проводился с использованием про грамм «PerlPrimer v. 1.1.19» и «CLC DNA Workbench 6». Уникальность ПЦР-праймеров проверяли посред ством поиска их последовательностей в базе данных «GenBank» при помощи алгоритма «BlastN». Выделе ние тотальной РНК из биоптатов (около 25 мг ткани ПЖ) и осадков мочи (полученных при центрифуги ровании 10 мл мочи) производили с применением набора «RNeasy mini kit» (Qiagen, Голландия) в соот ветствии с рекомендациями изгото вителя. ОТ тотальной РНК осу ществляли при помощи набора «RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis» (Fermentas, Литва) в соответствии с протоколом изгото вителя. В качестве праймеров для ОТ использовали смесь олигонуклеоти дов KLK3-R1 и PCA3-R3 в концент рации каждого 1 мкМ. Постановку ОТ-ПЦР-РВ осуществляли с исполь зованием 2,5Х ПЦР-смесей (Синтол, Россия). Для анализа кривых плавле ния ПЦР-продуктов, полученных с использованием праймеров под PCA3 и KLK3, применяли реакцион ную смесь того же производителя с добавлением интеркалирующего красителя EvaGreen. В реакционные смеси объемом 20 мкл добавляли 1 мкл препарата кДНК и смесь 4 праймеров и 2 зондов (PCA3 и KLK3) до финальной концентрации каждого 0,2 мкМ. ПЦР проводили в приборе «C1000» c оптическим модулем «CFX96» (BioRad, США) согласно следующей программе:

  • первичная денатурация — 95°С, 5 мин;
  • денатурация — 94°С, 15 с;
  • отжиг и элонгация — 60°С, 60 с.

Длительность программы со ставила 45 циклов. Калибровочные кривые для значений порогового цикла Ct строили с использованием серийных 10-кратных разведений ДНК-матриц (кДНК или плазмидных ДНК). Расчеты относительных уровней мРНК осуществляли в про грамме «Microsoft Excel».

Клонирование полученных ПЦР продуктов производили с применением вектора pAL-TA (Евроген, Рос сия) при помощи стандартных мето дов молекулярного клонирования.

Анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики и коэффициента корреляции R2 в программном па кете «LibreOffice Calc», «Microsoft Excel 2010». Количественные данные представлены в формате: среднее (M) ± стандартная ошибка среднего (m). Построение диаграмм проводили в приложении «SciDAVis».

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе настоящего исследования была разработана тест-система для проведения ОТ-ПЦР-РВ, пред назначенная для одновременной детекции в одной пробирке мРНК продуктов двух генов — PCA3 и KLK3 (ген, кодирующий белок ПСА). Определение относительного уровня экспрессии мРНК гена PCA3 с помо щью созданной тест-системы осу ществляется путем сравнения зна чения порогового цикла амплифика ции PCA3 со значением порогового цикла для мРНК гена KLK3, являю щегося конститутивно экспресси рующимся РНК-маркером клеток ПЖ. Таким образом, уровень экс прессии мРНК PCA3 выражается как отношение PCA3/KLK3. Превышение данного параметра над рефе ренсными значениями будет указы вать на малигнизацию клеток пред стательной железы. В качестве мишени для амплификации на матрице кДНК гена PCA3 был выбран уча сток экзон-экзонного соединения между экзонами 2 и 3. Таким обра зом, была снижена вероятность ам плификации на матрице остаточных количеств геномной ДНК, присут ствующей в препаратах РНК и кДНК из ПЖ и мочи. Мишенью для амплификации на матрице гена KLK3 был избран участок соединения экзонов 1 и 2. Данный район присутствует во всех изоформах мРНК, синтезирующихся с гена KLK3 (рис. 1).

Рис.1. Структура генов PCA3 (А) и KLK3 (Б). Примечание. Экзоны обозначены прямоугольни ками, интроны — стрелками. Для гена KLK3 приве дены 4 альтернативные формы мРНК

Рис.2. Кривые амплификации, полученные с ис пользованием созданной тест-системы и набора из 5 разведений кДНК из рака ПЖ. Примечание. Синие кривые — KLK3, оранжевые кривые — PCA3

Для изучения специфичности и чувствительности тест-системы, со стоящей из 2 пар праймеров и 2 Taq man-зондов, комплементарных мРНК генов PCA3 и KLK3 человека, были проведены испытания на 6 модель ных образцах биоматериала, пред ставляющих собой биоптаты пред стательной железы, полученные от больных с верифицированным диагнозом РПЖ. Образцы комплементарной дезоксирибонуклеиновой ки слоты (кДНК), выделенные из пере численных образцов, были исполь зованы для приготовления серийных 10-кратных разведений в диапазоне 100–10–4 и протестированы с ис пользованием созданной тест-си стемы. Для определения достовер ности количественной детекции и эффективности амплификации целевых фрагментов кДНК построены калибровочные графики зависимо сти порогового цикла Ct от относи тельной концентрации кДНК. Было показано, что коэффициент корре ляции R2 для генов PCA3 и KLK3 превышает 0,99, а эффективность амплификации во всех случаях близ ка к 100% (рис. 2).

Для изучения специфичности ПЦР-амплификации фрагментов кДНК генов PCA3 и KLK3 выполнили ана лиз кривых плавления и провели электрофорез полученных ПЦР-про дуктов. Результаты эксперимента пред ставлены на рисунке 3. Как видно, оба ПЦР-продукта (PCA3 и KLK3) пред ставляют собой гомогенные фраг менты ДНК с ожидаемой молекулярной массой и температурой плавления (87,5 и 86 °С), соответствующей расчетной (рассчитана по последовательности фрагментов с использованием программы «PerlPrimer»).

Рис.3. Электрофорез и анализ кривых плавления ПЦР-продуктов генов PCA3 и KLK3, полученных на мат рице образца кДНК из биопсии рака ПЖ с использованием разработанной тест-системы. Примечание. П.н. — пар нуклеотидов

Рис.4. «Ящичковые» диаграммы распределения значений индекса PCA3 (А) и сывороточных кон центраций ПСА (Б) в обследуемых группах паци ентов. Примечание. К — контрольная группа; ДГПЖ — группа пациентов с ДГПЖ; РП — группа пациентов с раком ПЖ. «Ящички» соответствуют диапазонам значений в 25–75-м центилях, «усы» — в 5–95-м центилях, крестиками отмечены край ние значения. Средние обозначены квадратами, медианы — перекладинами

Среднее значение индекса PCA3 у группы пациентов с РПЖ составило 135,55±31,02, у пациентов с ДГПЖ — 41,89±17,72, а у лиц контрольной группы — 3,17±3,12 (табл. 1). Меди аны индексов PCA3 были равны 82,3; 20,56 и 0,11 соответственно в 1-й, 2-й и 3-й группах. Средние значения концентрации ПСА в сыворотке, определенные у групп пациентов с РПЖ и ДГПЖ, составили 4,4±0,53 и 9,86±1,3 нг/мл, соответственно (рис. 4).

При анализе результатов ин декса РСА3 различных групп пациентов получена статистически досто верная разница уровня баллов РСА3 между группами РПЖ и ДГПЖ (р< 0,01), РПЖ и контрольной груп пой (р< 0,0001). Уверенной статистически достоверной разницы индекса РСА3 между группой ДГПЖ и конт рольной группой не получено (р=0,059). Выраженной корреляции между значениями индекса PCA3 и сывороточными концентрациями ПСА также обнаружено не было (р=0,18). Не получено корреляций и между уровнем индекса РСА3 группы РПЖ и баллами гистологи ческого материала по системе града ции Глисона (р=0,337), не получено убедительной корреляции между ин дексом РСА3 и стадией заболевания (р=0,0568), процентом пораженной ткани ПЖ (р=0,069). Исходя из полу ченных данных, было выбрано поро говое значение индекса PCA3, равное 50. Превышение индекса PCA3 над пороговым значением (диагностиче ская чувствительность теста) было обнаружено у 75% больных с верифи цированным диагнозом РПЖ. В то же время специфичность теста соста вила 87,5%. Для сравнения, специфичность теста ПСА (с пороговым значением 4 нг/мл) в данной когорте больных оказалась равной лишь 68,75%. Негативная предсказатель ная ценность теста PCA3 составила 67%. Среди пациентов группы РПЖ и индексом PCA3 ниже порогового значения 5 больных имели очень низкие значения индекса PCA3 (1,52–7,6), а еще двое — значения, приближающиеся к 50 (29,75 и 32,37). В группе больных с ДГПЖ большинство пациентов имели значения индекса PCA3 в интервале от 10 до 40. В то же время в 2 образ цах были выявлены высокие значения индекса (114,61 и 231,87), что может быть связано с наличием не диагностированной злокачествен ной опухоли. Значения индекса PCA3 в группе пациентов, не имеющих РПЖ или ДГПЖ, находились в диапазоне от 0 до 9,4.

Таблица1. Корреляция индекса РСА3 с другими показателями пациентов

Параметры Группы пациентов
РПЖ ДГПЖ Условно здоровые
Возраст 51-81 56-82 36-58
Объем ПЖ, см3 20 87 (41,5) 35 138 (78) 1335 (23)
Общий ПСА,нг/мл 4,41 25,0 (10,2) 1,7 6,94 (4,5) 0,4 2,7 (0,9)
Индекс РСА3 1,62-652,19 (135,72) 0,1-231,87 (41,9) 0,07-13,0 (3,9)
Количество пациентов 28 13 8
Сумма Глисона   Индекс РСА3
3+3=6 7 пациентов 1,62 – 177,36 (59,15)
3+4=7 13 пациентов 4,77 – 652,19 (139,12)
4+3=7 7 пациентов 7,6 – 628,91 (164,89)
4+4=8 0 пациентов -----------------------
4+5=9 0 пациентов -----------------------
патоморфоз 1 пациент 282,94
Стадия после РПЭ    
Т2аN0М0 1 пациент 2,86
Т2вN0М0 1 пациент 177,17
Т2сN0М0 13 пациентов 1,62 – 652,19 (131,008)
Т3аN0М0Т3вN0М0 13 пациентов 4,77 – 628, 91 (147,021)

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на существующее многообразие новых неинвазивных методов ранней диагностики РПЖ, определение общего ПСА с %fPSA, ПРИ, ТРУЗИ с последующей транс ректальной биопсией ПЖ остаются основными методами в повседнев ной практике уролога. Рутинное из мерение уровня простат-специфи ческого антигена привело к увеличе нию количества выполняемых био псий ПЖ. Снижение порога возраст ных норм ПСА привело, в свою оче редь, к увеличению числа т.н. «не нужных» биопсий (к гипердиагнос тике клинически незначимого РПЖ). В настоящее время только у 35% па циентов с уровнем общего ПСА 4-10 нг/мл удается при биопсии выявлять РПЖ, а у 20-25% мужчин имеет место “ПСА-негативный” РПЖ. Очевидно, что простат-специфический антиген, как самостоятельный маркер, имеет ограниченные диагности ческие возможности. В этой связи очевидна необходимость в поиске новых чувствительных, специфич ных и неинвазивных методов, позво ляющих проводить диагностику РПЖ на ранних стадиях развития за болевания, необходимость в увеличении процента позитивных биопсий и сокращении количества т.н. «ненужных» биопсий, дифференци ровке «клинически значимого» от «клинически незначимого» РПЖ, не обходимость в сокращении количества пациентов, которым показано активное лечение.

По разным литературным дан ным, чувствительность тест-систем ПСА достаточно высока – 68,4 94,0%, а специфичность является низкой и составляет не более 44 57,9%. При апробации в 2002 году тест-системы РСА3 первого поколе ния в Голландии в исследовании приняло участие 108 пациентов, при этом чувствительность теста PCA3 составила 67%, а специфичность – 83%, что позволило сделать вывод о клинической перспективности нового диагностического теста [16]. Schilling D. et al. в 2010 году опубли ковали данные своего исследования, в котором при чувствительности тест-системы РСА3 в 90% специфич ность составила 36%, негативная предсказательная ценность 83% [32]. Диагностическая чувствительность нашего теста составила предвари тельно 75% , в то же время специ фичность – 87,5%. Негативная пред сказательная ценность теста на PCA3 составила 67%.

В настоящее время индекс в 35 баллов является установленным по роговым значением современных тест-систем РСА3 [20, 21, 22, 23]. Haese А. et al. в 2008 году опублико вали результаты большого популя ционного исследования, проведен ного в Европе на большой когорте больных, перенесших повторную биопсию ПЖ. В этом исследовании в 39% случаев с индексом РСА3≥35 был выявлен РПЖ, по данным гистологи ческого заключения, и только в 22% – с индексом РСА3< 35 (р=0,001)[22]. Galasso F. et al. в 2010 году опублико вали результаты итальянского муль тицентрового исследования, в котором у 445 пациентов был вы явлено значения индекса РСА3 ≥35 (48,2%), у 472 пациентов – < 35 (51,58%). Из 443 больных 105 паци ентам была выполнена биопсия ПЖ или повторная биопсия ПЖ. Исследователи обнаружили, что у 27 паци ентов (25,71%) РПЖ не выявлен, у 37 (35,24%) выявлен ASAP либо высо кий ПИН, а у 41 больного (39,05%) вы явлена аденокарцинома ПЖ. Сред нее значение индекса РСА3 в группе негативных биопсий составило 54,9 баллов, в группе диагностирован ного РПЖ – 141,6 баллов, а в группе ASAP и ПИН значение индекса было промежуточным и составило 79,6 баллов. Пороговым значением ин декса РСА3 было выбрано (подтвер ждено) 35 баллов [33].

Вместе с тем, оптимальный пороговый уровень до последнего времени остается дискутабельным. Не которые публикации свидетельст вуют, что пороговое значение 20-25 баллов может быть более пред почтительным, позволяющее улуч шить диагностику РПЖ. Ruffion A. et al. и Hansen J. et al. в 2013 году включили в построение своих номо грамм индекс РСА3 с пороговым значением 21 и 35 баллов [30, 31].

Выбранный порог в 50 баллов в нашем исследовании предваритель ный, обусловленный, в первую оче редь, небольшим количеством мате риала и особенностями отечествен ной тест-системы.

ВЫВОДЫ

Создан образец диагностической тест-системы для ранней неинвазивной диагностики рака предста тельной железы, основанной на количественной детекции мРНК гена PCA3 в осадке мочи методом ОТ ПЦР-РВ. Отработана методика его применения совместно с детекти рующим термоциклером «CFX96» (BioRad, США). Установлена высо кая аналитическая специфичность и чувствительность разработанного метода по выявлению специфиче ских фрагментов мРНК. Показана возможность использования разра ботанной тест-системы для обнару жения мРНК гена PCA3 в осадках мочи и способность тест-систе мы выявлять значительное превы шение параметра PCA3/KLK3 в об разцах биоматериала, полученных от больных РПЖ, по сравнению с об разцами от здоровых людей. В ходе проведенных исследований обнару жены достаточно высокие показа тели диагностической чувствитель ности, специфичности и негативной предсказательной ценности для ран него неинвазивного скринингового выявления РПЖ. На основании по лученных данных можно сделать вывод о целесообразности выполне ния дальнейших лабораторных ис следований, направленных на совер шенствование тест-системы, уточне ние ее аналитических характеристик и диагностической ценности, а также проведения клинических испытаний полученной тест-системы на расши ренном контингенте пациентов.

Применение РСА3 в повседнев ной практике может способствовать увеличению специфичности диагно стики РПЖ и уменьшить количество «ненужных» биопсий ПЖ. Несмотря на значительное число печатных работ, посвященных данной про блеме, их количество продолжает увеличиваться, но четких руководств к действию в этой области пока не существует, и решение по каждому конкретному случаю принимается индивидуально. Не определены оптимальные сроки к определению ин декса РСА3 после первичной биоп сии ПЖ, оптимальные сроки и пока зания к определению индекса РСА3 в рамках активного наблюдения группы клинически незначимого РПЖ. Не изучена возможность ис пользования РСА3, вместе с индиви дуальными данными обследования пациента, с индексом PHI или % 2proPSA, а также многие другие нюансы. Необходимо отметить, что существующие в Европе тест-системы PCA3 являются дорогостоящими и в Российской Федерации не представлены.

Работа поддержeна грантом Российского Гуманитарного Научного Фонда № 11-06-00532а

ЛИТЕРАТУРА

1. Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Состояние онко логической помощи населению России в 2011 г. М., 2012; С. 17-29.

2. Воробьев А.В., Крживицкий П.И. Перспективы профилак тики, диагностика и стадирование рака предстательной же лезы. // Практическая онкология. 2008. Т. 9, N 2. С. 71-82.

3. Лоран О.Б., Пушкарь Д.Ю., Франк Г.А. Простат-специфиче ский антиген и морфологическая характеристика рака предста тельной железы: Руководство для врачей. М.: МЕД пресс, 1999.

4. Babaian RJ, Mettlin C, Kane R, Murphy GP, Lee F, Drago JR, Chesley A. The relationship of prostate-specific antigen to digital rectal examination and transrectal ultrasonography: findings of the Ameri can Cancer Society National Prostate Cancer Detection Project. // Cancer. 1992. Vol. 69, N 5. P. 1195-1200.

5. Cooner WH, Mosley BR, Ruterford CL, Beard JH, Pond HS, Terry WJ, Igel TC, Kidd DD. Prostate cancer detection in a clinical uro logical practice by ultrasonography, digital rectal examination and prostate specific antigen. // J Urol. 1990. Vol. 143, N 6. P. 1146-1152.

6. Лоран О.Б., Пушкарь Д.Ю., Степанов В.П., Крохотина Л.В. Дифференциальная диагностика опухолей предстательной же лезы с помощью определения уровня простат-специфического антигена сыворотки крови. М., 2000.

7. Говоров А.В. Оптимизация трансректальной биопсии про статы в диагностике рака предстательной железы: Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2002. 17 с.

8. Hodge KK, McNeal JE, Terris MK, Stamey TA. Random system atic versus directed ultrasound guided transrectal core biopsies of the prostate. // J Urol. 1989. Vol. 142. P. 71-75.

9. Hammerer P, Huland H. Systemic sextant biopsies in 651 patients referred for prostate evaluation. // J Urol. 1994. Vol. 151, N 1. P. 99-102.

10. Svetec D, McCabe K, Peretsman S, Klein E, Levin H, Optenberg S, Thompson I. Prostate rebiopsy is a poor surrogate of treatment efficacy in localized prostate cancer. // J Urol. 1998. Vol. 159, N 5. P. 1606-1608.

11. Guichard G, Larré S, Gallina A, Lazar A, Faucon H, Chemama S, Allory Y, Patard JJ, Vordos D, Hoznek A, Yiou R, Salomon L, Abbou CC, de la Taille A. Extended 21-sample needle biopsy protocol for diagnosis of prostate cancer in 1000 consecutive patients. // Eur Urol. 2007. Vol. 52. P. 430–435.

12. Singh H, Canto EI, Shariat SF, Kadmon D, Miles BJ, Wheeler TM, Slawin K.M. Predictors of prostate cancer after initial negative systematic 12 core biopsy. // J Urol. 2004. Vol. 171. P. 1850–1854.

13. Olivier C, Bernard М. Biomarkers of Aggressiveness in Prostate Can cer.// in book “Prostate Cancer Diagnostic and therapeutic Advances” [Ed. Dr. Philippe E. Spiess]. 2011. P. 3-20.

14. Bussemakers MJ, van Bokhoven A, Verhaegh GW, Smit FP, Karthaus HF, Schalken JA, Debruyne FM, Ru N, Isaacs WB. DD3: a new prostate specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. // Cancer Res. 1999. Vol. 59, N 23. P. 5975-5979.

15. Bourdoumis A, Papatsoris AG, Chrisofos M, Efstathiou E, Sko larikos A, Deliveliotis C. The novel prostate cancer antigen 3 (PCA3) biomarker. // Int Braz J Urol. 2010. Vol. 36, N 6. P. 665–668.

16. Day JR, Jost M, Reynolds MA, Groskopf J, Rittenhouse H. PCA3: from basic molecular science to the clinical lab. // Cancer Lett. 2011. Vol. 301, N 1. P. 1–6.

17. de Kok JB, Verhaegh GW, Roelofs RW, Hessels D, Kiemeney LA, Aalders TW, Swinkels DW, Schalken JA. DD3 (PCA3), a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors. // Cancer Res. 2002. Vol. 62, N 9. P. 2695-2698.

18. Fradet Y, Saad F, Aprikian A, Dessureault J, Elhilali M, Trudel C, Mâsse B, Piché L, Chypre C. uPM3, a new molecular urine test for the detection of prostate cancer. // Urology. 2004. Vol. 64, N 2. P. 311-315.

19. Tinzl M, Marberger M, Horvath S, Chypre C. DD3 PCA3 RNA analysis in urine--a new perspective for detecting prostate cancer. // Eur Urol. 2004. Vol. 46, N 2. P. 182-186.

20. Deras IL, Aubin SM, Blase A, Day JR, Koo S, Partin AW, Ellis WJ, Marks LS, Fradet Y, Rittenhouse H, Groskopf J. PCA3: a molecular urine assay for predicting prostate biopsy outcome. // J Urol. 2008. Vol. 179, N 4. P. 1587-1592.

21. Groskopf J, Aubin SM, Deras IL, Blase A, Bodrug S, Clark C, Brentano S, Mathis J, Pham J, Meyer T, Cass M, Hodge P, Macairan ML, Marks LS, Rittenhouse H. APTIMA PCA3 molecular urine test: development of a method to aid in the diagnosis of prostate cancer. // Clin Chem. 2006. Vol. 52, N 6. P. 1089-1095.

22. Haese A, de la Taille A, van Poppel H, Marberger M, Stenzl A, Mulders PF, Huland H, Abbou CC, Remzi M, Tinzl M, Feyerabend S, Stillebroer AB, van Gils MP, Schalken JA. Clinical utility of the PCA3 urine assay in European men scheduled for repeat biopsy. // Eur Urol. 2008. Vol. 54, N 5. P. 1081-1088.

23. Marks LS, Bostwick DG. Prostate Cancer Specificity of PCA3 Gene Testing: Examples from Clinical Practice. // Rev Urol. 2008. Vol. 10, N 3. P. 175–181.

24. van Gils MP, Hessels D, van Hooij O, Jannink SA, Peelen WP, Hanssen SL, Witjes JA, Cornel EB, Karthaus HF, Smits GA, Dijkman GA, Mulders PF, Schalken JA. The time-resolved fluorescence-based PCA3 test on urinary sediments after digital rectal examination; a Dutch multicenter validation of the diagnostic performance. // Clin Cancer Res. 2007. Vol. 13, N 3. P. 939-943.

25. van Gils MP, Hessels D, Hulsbergen-van de Kaa CA, Witjes JA, Jansen CF, Mulders PF, Rittenhouse HG, Schalken JA. Detailed analysis of histopathological parameters in radical prostatectomy specimens and PCA3 urine test results. // Prostate. 2008. Vol. 68. P. 1215–1222.

26. Auprich M, Chun FK, Ward JF, Pummer K, Babaian R, Augustin H, Luger F, Gutschi S, Budäus L, Fisch M, Huland H, Graefen M, Haese A. Critical assessment of preoperative urinary prostate cancer antigen 3 on the accuracy of prostate cancer staging. // Eur Urol. 2011. Vol. 59. P. 96–105.

27. van Poppel H, Haese A, Graefen M, de la Taille A, Irani J, de Reijke T, Remzi M, Marberger M. The relationship between Prostate CAncer gene 3 (PCA3) and prostate cancer significance. // BJU Int. 2012. Vol. 109, N 3. P. 360-366.

28. Chun FK, de la Taille A, van Poppel H, Marberger M, Stenzl A, Mulders PF, Huland H, Abbou CC, Stillebroer AB, van Gils MP, Schalken JA, Fradet Y, Marks LS, Ellis W, Partin AW, Haese A. Prostate cancer gene 3 (PCA3): Development and internal validation of a novel biopsy nomogram. // Eur Urol. 2009. Vol. 56. P. 659–668.

29. Wu AK, Reese AC, Cooperberg MR, Sadetsky N, Shinohara K. Utility of PCA3 in patients undergoing repeat biopsy for prostate cancer. // Prostate Cancer Prostatic Dis. 2012. Vol. 15. P. 100–105.

30. Hansen J, Auprich M, Ahyai SA, de la Taille A, van Poppel H, Mar berger M, Stenzl A, Mulders PF, Huland H, Fisch M. Initial prostate biopsy: Development and internal validation of a biopsy-specific nomogram based on the prostate cancer antigen 3 assay. // Eur Urol. 2013. Vol. 63. P. 201–209.

31. Ruffion A, Devonec M, Champetier D, Decaussin-Petrucci M, Rodriguez-Lafrasse C, Paparel P, Perrin P, Vlaeminck-Guillem V. PCA3 and PCA3-Based nomograms improve diagnostic accuracy in patients undergoing first prostate biopsy. // Int J Mol Sci. 2013. Vol. 14, N 9. P. 17767–17780.

32. Schilling D, Hennenlotter J, Munz M, Bökeler U, Sievert KD, Stenzl A. Interpretation of the prostate cancer gene 3 in reference to the individual clinical background: implications for daily practice. // Urol Int. 2010. Vol. 85, N 2. P. 159-165.

33. Galasso F, Giannella R, Bruni P, Giulivo R, Barbini VR, Disanto V, Leonardi R, Pansadoro V, Sepe G. PCA3: a new tool to diagnose prostate cancer (PCa) and a guidance in biopsy decisions. Prelimi nary report of the UrOP study. // Arch Ital Urol Androl. 2010. Vol. 82, N 1. P. 5-9.

Прикрепленный файлРазмер
Скачать статью410.4 кб