Проблема мужской инфертильности остается чрезвычайно актуальной уже в течение десятилетий, несмотря на достижения в области диагностики причин бесплодия, современной фармакологии и клеточных технологий. Последнее направление представляется весьма перспективным, поскольку современные научные данные свидетельствуют, что трансплантация культивированных клеток с высоким пролиферативным потенциалом (стволовых, прогениторных) различного происхождения (мезенхимных клеток костного мозга, жировой ткани, пупочного канатика, предшественников клеток Лейдига и сперматогониальных клеток) позволяет стимулировать регенерацию и функциональную активность поврежденных тканевых структур [1-5]. Терапевтический эффект во многом связан с действием комплекса факторов роста и цитокинов, секретируемых пересаженными клетками. Более того, показано, что использование продуктов секреции мезенхимных стволовых клеток для стимуляции нарушенного сперматогенеза по эффективности сопоставимо с эффектом трансплантации культуры этих клеток [6].
Для достижения длительного терапевтического эффекта необходимо сохранение жизнеспособности и функциональной активности пересаженных клеток в чужеродной для них зоне за счет воспроизведения благоприятного микроокружения [7- 9]. С этой целью используют различные препараты коллагена, а также бесклеточные матриксы, создающие «ниши» для пересаженных клеток [10,11]. Но наиболее оптимальным является микроокружение собственного органа. Нами ранее было показано, что при трансплантации фрагментов ткани неонатального яичка, богатой низкодифференцированными стволовыми/прогениторными клетками под капсулу почки, происходит стойкое их приживление с формированием типичных органных структур – канальцев, выстланных сперматогенным эпителием, интерстициальных клеток Лейдига, придатка яичка и семявыносящего протока [12]. Все это свидетельствует о кооперативном взаимодействии клеток, пересаженных в составе тканевого трансплантата.
Учитывая эти данные, мы провели исследование на крысах для изучения возможности восстановления нарушенного сперматогенеза при пересадке ткани неонатального яичка под белочную оболочку яичка в модели абдоминального крипторхизма.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проведены на 20 белых беспородных крысах-самцах массой 250-280 г. Все эксперименты выполнялись в соответствии с требованием Хельсингского соглашения о гуманном обращении с животными.
У 16 крыс с целью нарушения сперматогенеза предварительно моделировали абдоминальную форму крипторхизма, перемещая оба яичка из мошонки через паховый канал в брюшную полость и фиксируя их лигатурой к боковой стенке. Через 2 недели яичко возвращали обратно в мошонку. При этом в контрольной серии (1-я серия, 8 крыс) никаких манипуляций не проводили, а в опытной серии (2-я серия 8 крыс) производили трансплантацию тестикулярной ткани, полученной от новорожденных крысят (1-2 суток после рождения), под белочную оболочку яичка. У 4 крыс никаких вмешательств не производили. Они служили контролем для получения нормальных значений изучаемых показателей.
Метод трансплантации под белочную оболочку яичка был выбран в связи с иммунопривилегированностью этой зоны вследствие наличия гематотестикулярного барьера, что позволяет приживать генетически чужеродным тканям и клеткам. Методика трансплантации заключалась в надсечении белочной оболочки яичка в бессосудистой зоне, формировании с помощью микрохирургического зонда под белочной оболочкой тоннеля и помещении в него фрагмента неонатальной тестикулярной ткани с последующим ушиванием разреза оболочки яичка.
Животных обследовали через 1 и 3 месяца после низведения яичка. В эти сроки брали пробы крови для определения уровня тестостерона в крови, удаляли яички, определяли их массу взвешиванием и брали пробы ткани из области трансплантации для гистологического и морфометрического исследования. Концентрацию тестостерона в сыворотке крови определяли иммунохемилюминесцентным методом на иммунохимическом анализаторе Access 2 (Beckman Coulter, США). Гистологическое исследование проводили по стандартной методике с окрашиванием парафиновых срезов гематоксилином и эозином.
Статистическую обработку цифровых данным проводили по методу Стьюдента с использованием критерия достоверности t. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Во всех экспериментах через 2 недели после перемещения яичек в брюшную полость развивалась их выраженная гипотрофия. Масса органа уменьшалась с 1,87±0,03 г до 0,79±0,02 г (p<0,001). В контрольной серии (без трансплантации) через 1 и 3 месяца после низведения яичек в мошонку их масса возрастала незначительно, но статистически достоверно – до 0,92±0,03 и 0,96±0,03 г соответственно (p<0,05). В опытной серии (с трансплантацией неонатальной тестикулярной ткани) через 1 и 3 месяца после низведения яичек во всех опытах выявили приживший трансплантат, размеры которого возрастали с увеличением сроков наблюдения (рис. 1).
Рис. 1. Внешний вид яичка крысы через 1 месяц (А) и через 3 месяца (Б) после трансплантации ткани неонатального тестикула под белочную оболочку. Стрелкой указан приживший трансплантат
При этом масса органа в опытной серии возрастала в большей степени, чем в контрольных опытах, приближаясь к нормальным значениям – до 1,26±0,02 и 1,59±0,03 г через 1 и 3 месяца, соответственно. Различия между контрольной и опытной группами оказались статистически значимыми с достоверностью p<0,001 (рис. 2).
Рис. 2. Влияние трансплантации неонатальной тестикулярной ткани на восстановление массы крипторхированного яичка крысы (в граммах). *** достоверность различий между группами p<0,001
Гистологическое исследование крипторхированных яичек выявило значительное нарушение сперматогенеза с появлением множества полностью запустевших или склерозированных канальцев, а также канальцев с резко дистрофированным эпителием. После низведения яичек в мошонку в контрольной серии картина менялась незначительно. Даже через 3 месяца по-прежнему сохранялось большое количество канальцев, склерозированных или полностью лишенных сперматогенного эпителия, а в канальцах с сохраненным эпителием выявляли только незрелые формы клеток (рис. 3).
Рис. 3. Гистологическая картина крипторхированных яичек перед низведением в мошонку (А) и через 3 месяца после низведения (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100х
При исследовании яичек опытной серии выявили, что в прижившем трансплантате уже через один месяц сформировались зрелые семенные канальцы, выстланные сперматогенным эпителием разной степени зрелости. Дифференцировка клеток в канальцах доходила до стадии сперматоцитов 1-го порядка. В интерстициальной ткани трансплантата обнаружены кровеносные сосуды и скопления клеток Лейдига. Трансплантат окружен соединительнотканной капсулой, отграничивающий его от ткани яичка реципиента (рис. 4). Через 3 месяца сохранялась такая же картина. Таким образом, пересаженная незрелая тестикулярная ткань подвергалась нормальному развитию с формированием типичных структур зрелого органа, но с незавершенным сперматогенезом.
Рис. 4. Трансплантат неонатальной тестикулярной ткани через 1 месяц после пересадки под белочную оболочку крипторхированного яичка. А – общий вид трансплантата. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 50х Б – семенные канальцы трансплантата, выстланные сперматогенным эпителием разной степени зрелости. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.200х
При этом обнаружили значительное улучшение состояния сперматогенного эпителия в семенных канальцах собственного яичка реципиента. Значительно уменьшалось число запустевших канальцев по сравнению с контрольной серией. Большинство канальцев были выстланы сперматогенным эпителием, причем во многих канальцах выявлялся полностью завершенный сперматогенез (выявляли сперматозоиды в просвете канальцев) (рис. 5).
Рис. 5. Гистологическая картина крипторхированного яичка через 3 месяца после низведения в мошонку с одновременной трансплантацией неонатальной тестикулярной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400х
С целью большей объективизации изменений, вызванных трансплантацией неонатальной тестикулярной ткани, провели количественный анализ ряда существенных показателей, характеризующих состояние крипторхированных яичек в опытной и контрольной сериях, а именно, количество запустевших канальцев на единицу площади препарата, число клеток Сертоли на 1 каналец, число клеток Лейдига на единицу площади препарата, а также наличие клеток сперматогенеза разной степени дифференцировки (табл. 1).
Таблица 1. Морфометрические показатели крипторхированных яичек через 1 и 3 месяца после их низведения
Показатели | 1 месяц | 3 месяца | ||
---|---|---|---|---|
Контроль | Опыт | Контроль | Опыт | |
Доля запустевших канальцев (%) | 75,1±6,3 | 6,2±0,3*** | 69,8±5,1 | 3,2±0,2*** |
Кол-во клеток Сертоли на 1 каналец | 3,3±0,7 | 34,6±2,2*** | 10,2±0,9 | 41,3±1,8 |
Кол-во клеток Лейдига на ед. площади препарата | 1,6±0,6 | 41,1±3,6*** | 3,2±0,6 | 44,8±3,9*** |
В контрольной серии доля полностью запустевших канальцев составила через 1 месяц после низведения 75,1±6,3%, а через 3 месяца - 69,8±5,1%, тогда как в опытной серии (с трансплантацией неонатальной тестикулярной ткани) их доля значительно уменьшилась, составив всего 6,2±0,3% и 3,2±0,2% соответственно (p<0,001 по сравнению с контрольной серией).
Число клеток Сертоли на 1 каналец в контрольной серии составило в среднем 3,3±0,7 клеток через 1 месяц и 10,2±0,9 клеток через 3 месяца после низведения яичек, а в опытной серии этот показатель возрос до 34,6±2,2 и 41,3±1,8 клеток соответственно (p<0,001 по сравнению с контрольной серией).
Число интерстициальных клеток Лейдига на единицу условной площади в контрольной серии составило 1,6±0,6 и 3,2±0,6 через 1 и 3 месяца после низведения яичек, тогда как в опытной серии этот показатель составил 41,1±3,6 и 44,8±3,9 клеток через 1 и 3 месяца соответственно (p<0,001 по сравнению с контрольной серией).
Важным показателем состояния сперматогенеза является его завершенность, определяемая гистологически по выявлению клеток сперматогенного эпителия разной степени зрелости вплоть до сперматозоидов. Проведенный анализ показал, что в контрольной серии в подавляющем большинстве опытов в канальцах с сохраненным сперматогенным эпителием выявляли блок сперматогенеза на уровне сперматогоний или сперматоцитов 1-го порядка (табл. 2). Через 1 месяц после низведения яичек лишь в 60% опытов в семенных канальцах выявляли темные сперматогонии А, а более зрелые формы (сперматогонии Б и сперматоциты 1-го порядка) были обнаружена в канальцах лишь в 1 из 8 опытов. Более зрелые формы не выявлялись ни в одном из опытов этой серии. Через 3 месяца картина несколько улучшилась (сперматогонии А темные выявлены в канальцах в 100% случаев, сперматогонии Б – в 63% (5 из 8 опытов), сперматоциты 1-го порядка – в 38% (3 из 8 опытов), а сперматоциты 2-го порядка – в 13% (1 из 8 опытов). Сперматозоиды в просвете канальцев не выявлены ни в одном из экспериментов.
Таблица 2. Влияние трансплантации неонатальной тестикулярной ткани на восстановление нарушенного сперматогенеза в крипторхированных яичках
Серии | Сперматогонии А светлые | Сперматогонии А темные | Сперматогонии Б | Сперматоциты 1 порядка | Сперматоциты 2 порядка | Сперматозоиды |
---|---|---|---|---|---|---|
Через 1 месяц | ||||||
Контроль (1-я серия) | 100% | 60% | 12,5% | 12,5% | 0 | 0 |
Опыт (2-я серия) | 100% | 100% | 100%*** | 100%*** | 88%*** | 38%*** |
Через 3 месяца | ||||||
Контроль (1-я серия) | 100% | 100% | 63% | 38% | 13% | 0 |
Опыт (2-я серия) | 100% | 100% | 100% | 100%*** | 100%*** | 75%*** |
В то же время в опытной серии через 1 месяц после низведения яичек во всех опытах сперматогенез доходил до стадии сперматоцитов 1-го порядка, а в 38% (3 из 8 опытов) в просвете канальцев выявляли зрелые сперматозоиды. Через 3 месяца во всех опытах сперматогенез доходил до стадии сперматоцитов 2-го порядка, а в 75% (6 из 8 опытов) был полностью завершенным (в просвете канальцев выявляли сперматозоиды).
Поскольку мы выявили значительное восстановление популяции клеток Лейдига в крипторхированном яичке после трансплантации неонатальной тестикулярной ткани, было важно определить их функциональную активность, а именно способность к синтезу тестостерона. Определение его концентрации в крови показало, что после 2 недель пребывания яичек в брюшной полости уровень тестостерона снижается почти в 2 раза (с 2,51±0,3 нг/мл до 1,32±0,3 нг/мл). В контрольной серии опытов через 1 и 3 месяца после низведения яичек в мошонку он достоверно не менялся, составив 1,44±0,4 и 1,48±0,3 нг/мл соответственно. В то же время в опытной серии уже через 1 месяц уровень тестостерона возрастал до 2,13±0,4 нг/мл, а через 3 месяца достигал нормальных значений (2,87±0,5 нг/мл).
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что трансплантация неонатальной тестикулярной ткани, полученной от новорожденных крысят (1-2 суток после рождения), взрослым крысам с нарушением сперматогенеза путем моделирования абдоминальной формы крипторхизма приводит к стимуляции регенерации поврежденных структур органа, включая клетки Сертоли, клетки Лейдига и сперматогенный эпителий. При этом происходит полное восстановление сперматогенеза до стадии сперматозоидов, чего не происходит в контрольных опытах, где трансплантация ткани не выполнялась
Рис. 6. Влияние трансплантации неонатальной тестикулярной ткани на уровень тестостерона плазмы крови крыс с 2-недельным экспериментально вызванным крипторхизмом. *** различия достоверны при p<0,001 по сравнению с контрольной серией
В публикациях последних лет имеется много доказательств, что пересадка низкодифференцированных стволовых клеток внетестикулярного происхождения, обладающих высокой пластичностью, в частности мезенхимных стволовых клеток костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика, приводит к восстановлению сперматогенеза, нарушенного различными методами [4,13-16]. При этом имеются данные, что эти клетки способны трансформироваться в клетки Лейдига, продуцирующие тестостерон, с чем и связан их лечебный эффект [4,14]. Также описано положительное влияние трансплантации культивированных предшественников клеток Лейдига или стволовых клеток сперматогенного эпителия [2,3,5,17,18]. При этом также выявлено, что пересаженные в яичко сперматогонии могут трансформироваться в клетки Лейдига, секретирующие тестостерон [8], однако для этого необходима кооперация этих клеток с другими клетками их микроокружения. Если при трансплантации суспензии интерстициальной ткани, заключенной в альгинатные капсулы, в подкожную клетчатку кастрированных самцов крыс не выявляли достоверного возрастания уровня тестостерона в крови животных, то при совместной трансплантации интерстициальных клеток и семенных канальцев обнаружили формирование гормонально активных клеток Лейдига с нормализацией уровня тестостерона в крови. Авторы заключают, что интерстициальные клеткипредшественники нуждаются для дифференцировки в гормонально активные клетки в паракринных факторах, которые могут продуцироваться клетками семенных канальцев.
Именно такая ситуация имеет место в незрелых яичках плодов и новорожденных, где имеется полный набор клеток-предшественников всех структур развивающегося органа, что обеспечивает их кооперацию в условиях оптимального микроокружения («ниши»). Это предполагает, что трансплантация ткани плодных или неонатальных яичек может оказать не менее выраженный, а возможно, и более выраженные терапевтический эффект, чем при пересадке культивированных стволовых клеток какого-либо вида.
Наши эксперименты подтверждают это предположение. Трансплантация ткани неонатального яичка под белочную оболочку поврежденного тестикула (2 недели абдоминального крипторхизма) практически полностью восстанавливала способность к секреции тестостерона и нормализовала сперматогенез вплоть до стадии сперматозоидов. Такой выраженный эффект обеспечивался также длительным сохранением жизнеспособности пересаженной ткани, несмотря на антигенные различия трансплантата и реципиента (использовали аллогенный вариант трансплантации), что обеспечивалось, с одной стороны, наличием гематотестикулярного барьера, уменьшающего вероятность иммунного отторжения, а с другой стороны более низкой иммуногенностью незрелой тестикулярной ткани за счет низкой экспрессии антигенов гистосовместимости локуса МНС-1 и отсутствие антигенов локуса МНС-2 [19].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Трансплантация неонатальной тестикулярной ткани под белочную оболочку яичка с нарушенным сперматогенезом стимулирует регенерацию всех клеточных структур, включая клетки сперматогенного эпителия, клетки Сертоли и клетки Лейдига с восстановлением гормональной активности яичка и нормализацией сперматогенеза.
ЛИТЕРАТУРА
Прикрепленный файл | Размер |
---|---|
Скачать статью | 809.6 кб |