Патогенез доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) у человека связан с нарушениями регуляции в гипоталамо-гипофизарной системе и изменением интенсивности регуляторных сигналов, поступающих из этой системы к репродуктивным органам. К центральным патогенетическим звеньям развития данной патологии относят снижение эффективности регуляции функций гипоталамуса, осуществляемой по принципу обратной связи, изменение чувствительности клеток гипофиза к рилизинг-гормонам гипоталамуса и дисбаланс между продукцией эстрогенов и андрогенов. На органном уровне развитие ДГПЖ обусловлено повышением активности 5-альфа-редуктазы, способствующей превращению тестостерона в дигидротестостерон, увеличением синтеза тканевых факторов роста, повышением экспрессии андрогеновых и альфа1-адренорецепторов [1,2]. Среди аденогипофизарных гормонов, помимо фолликулостимулирующего и лютеинизирующего, на развитие ДГПЖ большое влияние оказывает пролактин, гиперсекреция которого в настоящее время считается весьма значимой причиной возникновения возрастных гиперпластических процессов в предстательной железе (ПЖ).

Моделирование патологических состояний у лабораторных животных является важным разделом экспериментальной медицины, поскольку от качества и воспроизводимости модели зависит не только обоснованность фундаментальных выводов о механизмах развития заболеваний, но и результаты доклинических испытаний медикаментозных препаратов. Одной из таких моделей, рекомендованных Министерством здравоохранения и социального развития РФ для доклинического изучения простатотропной активности лекарственных средств и широко используемых в эксперименте, является сульпиридная модель ДГПЖ [3,4,5]. Сульпирид — это антипсихотическое средство, нейролептические свойства которого связаны с антидофаминергическим действием. При длительном введении сульпирид индуцирует гиперсекрецию пролактина, что приводит к стимуляции пролиферации железистого эпителия в предстательной железе. Патогенез ацинарной гиперплазии при этом обусловлен повышением активности 5-альфа-редуктазы и увеличением чувствительности эпителиальных клеток к андрогенам [6].

Целью нашей работы явилось изучение особенностей морфологических изменений в железистой ткани ПЖ крыс при моделировании ДГПЖ с помощью сульпирида, а также выявление взаимосвязей между морфологическими показателями и маркерами функционального состояния эпителиальных клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 58 белых беспородных крысах-самцах в возрасте 16-18 месяцев, ранее использовавшихся в виварии для получения потомства. Эксперимент был проведен в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики», утвержденным и введенным в действие Приказом Ростехрегулирования от 02.12.2009 (№544-ст, ГОСТ Р 534342009). Все манипуляции с животными производили под эфирным наркозом, эвтаназию грызунов осуществляли путем цервикальной дислокации, также проводимой под эфирным наркозом.

Опытной группе животных (n=30) ежедневно внутримышечно в течение 30 дней вводили сульпирид (Эглонил, раствор для внутримышечного введения, 50 мг/мл, Sanofi Winth-rop Industrie, Франция) в дозе 40 мг/кг веса. Крысам контрольной группы (n=28) ежедневно внутримышечно вводили по 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Через 10 дней после последней инъекции все животные были выведены из эксперимента.

Абсолютную массу ПЖ и ее дорсолатеральных отделов определяли путем взвешивания на электронных весах. Относительную массу железы и ее дорсолатеральных отделов рассчитывали на 100 г веса животного. Для проведения морфологического исследования ткани фиксировали в 10% растворе формалина и подвергали стандартной гистологической проводке с последующей окраской парафиновых срезов гематоксилином и эозином. Морфометрические исследования проводились с помощью компьютерной системы анализа цветового изображения: микроскопа Leika DMRXA (Германия), системы анализа изображения Диаморф Цито® (Россия) и комплекта компьютерных программ Диаморф Ипсо® (Россия). Морфо-метрия проводилась по методу Г.Г. Автандилова [7]. В каждом препарате измеряли общую площадь, занимаемую железистой тканью, толщину эпителиального слоя, площади ядра и цитоплазмы эпителиальных клеток. Экспрессию ядерного антигена Ki-67 (маркер пролиферативной активности) определяли с помощью кроличьих моноклональных антител (SP6) (CELL MARQUE, США), экспрессию каспазы-3 (маркер апоптоза) — с использованием кроличьих поликлональных антител (GenTex, США). Результаты иммуногистохимических реакций выражали в виде процентного отношения окрашенных клеток к общему числу клеток в препарате.

Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью компьютерной программы IBM SPSS Statistics 19,0. Сравнения групп проводились методами непараметрической статистики с использованием критериев Манна-Уитни и хи-квадрат, корреляционные связи оценивались по величине и уровню значимости коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на то, что в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» указано, что для создания сульпиридной модели ДГПЖ наряду с крысами старше 10 мес. возможно использовать крыс молодого репродуктивного возраста [3], нам не удалось воспроизвести данную модель у половозрелых 8-9-месячных самцов при 30-дневном курсе сульпирида: абсолютные и относительные массы их ПЖ, а также массы дорсолатеральных отделов достоверно не отличались от контрольных значений.

У 16-18-месячных крыс через 10 дней после окончания 30-дневного курса сульпирида абсолютная масса ПЖ превышала контрольные значения на 17,3%, относительная масса — на 36,4% (табл. 1). При этом относительная масса дорсолатеральных долей у крыс с сульпиридной моделью ДГПЖ была больше контрольного уровня в 2 раза.

Таблица 1. Морфологические изменения в предстательной железе крыс с сульпиридной моделью ДГПЖ

Результаты представлены в виде M±m * отмечено наличие достоверных различий между группами (p < 0,05)

Морфологические изменения, развившиеся в ПЖ крыс после длительного введения сульпирида, были аналогичны морфологической картине ДГПЖ у человека [8]. При гистологическом исследовании в препаратах дорсолатеральных отделов ПЖ подопытных животных на долю железистого эпителия приходилось 75%, тогда как в контроле железистая ткань составляла не более половины всей площади. У крыс с ДГПЖ эпителиальные клетки имели преимущественно цилиндрическую форму в отличие от ПЖ контрольных животных (рис. 1,2), ацинусы которых были выстланы кубическим эпителием, что характерно для ткани дорсолатеральных отделов ПЖ интактных половозрелых крыс [9]. Толщина эпителиального слоя ацинусов у животных опытной группы была в 1,6 раза больше, чем в контроле, при этом эпителиальная ткань формировала многочисленные выросты. Изменение толщины эпителия было обусловлено преимущественно внутриклеточной гипертрофией: железистые клетки ПЖ крыс опытной группы, по сравнению с контролем, содержали в 1,5 раза больше цитоплазмы. В соответствии с этим, ядерно-цитоплазматическое отношение в эпителиоцитах у животных с ДГПЖ оказалось в 1,5 раза меньше.

Рис.1. Железистый эпителий дорсолатеральных отделов предстательной железы контрольной крысы (световая микроскопия, увеличение х1000, окраска гематоксилином и эозином)

Рис.2. Железистый эпителий дорсолатеральных отделов предстательной железы крысы с сульпиридной моделью ДГПЖ (световая микроскопия, увеличение х1000, окраска гематоксилином и эозином)

В настоящее время одним из распространенных молекулярных маркеров активного пролиферативного процесса в тканях является ядерный антиген Ki-67, экспрессирующийся в течение всех фаз клеточного цикла, кроме G0. В онкоурологии Ki-67 является критерием распространенности и степени дифференцировки опухолевого процесса [10,11]. При этом Ki-67 в 100% случаев выявляется в ядрах клеток низкодифференцированных опухолей ПЖ и не обнаруживается в клетках высокодифференцированной аденокарциномы [12]. В нашем исследовании наблюдалось полное отсутствие статистически значимых различий между уровнем экспрессии Ki-67 в клетках железистого эпителия у контрольных и подопытных животных (табл. 1). С одной стороны, это свидетельствует о несомненной доброкачественности моделируемого гиперпластического процесса, с другой — о том, что сульпиридная модель ДГПЖ только частично воспроизводит картину данной патологии у человека, поскольку у мужчин с ДГПЖ помимо признаков доброкачественной гиперплазии в ткани железы, как правило, обнаруживаются и очаги интраэпителиальной неоплазии низкой степени. По этой причине, как показано другими исследователями, относительная площадь экспрессии Ki-67 в железистых клетках в 3,5 раза превышает таковую у здоровых мужчин [13]. Мы полагаем, что экспрессия этого ядерного антигена в эпите-лиоцитах ацинусов подопытных животных регистрировалась на уровне показателей интактных крыс именно потому, что в ткани ПЖ через 10 дней после окончания курса сульпирида не было выявлено морфологических признаков злокачественного роста.

Мы выводили животных из эксперимента не сразу по окончании курса сульпирида (как делали другие исследователи [5,14]), а через 10 дней после последней инъекции препарата для того, чтобы одновременно с оценкой пролиферативного потенциала клеток железистого эпителия можно было проследить и появление признаков регрессии ДГПЖ. Известно, что одним из ведущих механизмов поддержания тканевого гомеостаза является апоптоз — запрограммированная гибель клеток, связанная с активацией разрушающих ДНК ферментов — каспаз. Среди всех каспаз наибольшей активностью обладает каспаза-3, поскольку после включения ее в процесс фрагментации ДНК клетка необратимо вступает на путь гибели [15]. В нашем исследовании у крыс с экспериментальной ДГПЖ через 10 дней после завершения курса сульпирида, морфологически отмечалась выраженная гиперплазия железистого эпителия, однако результаты иммуногистохимического анализа экспрессии каспазы-3 продемонстрировали наличие несомненных признаков активации апоптоза. В ПЖ подопытных животных доля клеток, содержащих этот проапоптотический фермент, была в 1,7 раза больше, чем в ткани ПЖ контрольных крыс (табл. 1). Этот факт свидетельствует о начале восстановительных процессов в гиперплазированной железе, ранее подвергшейся влиянию медикаментозно измененных гуморальных механизмов регуляции, и служит доказательством обратимости экспериментальной сульпиридной модели данной патологии.

Подтверждением того, что у здоровых крыс временная гиперпролактинемия не приводит к фатальным изменениям регуляции морфогенеза, явились данные корреляционного анализа, проведенного между показателями всех животных, участвующих в эксперименте — и контрольных, и подопытных (табл. 2). Наличие прямых связей между массой железы, объемом железистой ткани в ней, толщиной эпителия ацинусов, количеством цитоплазмы в эпителиоцитах и экспрессией каспазы-3 не зависело от того, в каком состоянии находились крысы — в интактном или же экспериментальном патологическом. Это означает, что в данном эксперименте в организме животных сохраняется способность регулировать и поддерживать тканевой гомеостаз и, следовательно, сульпиридная модель ДГПЖ, не провоцирующая возникновения неоплазии, является адекватной моделью естественных возрастных гиперпластических процессов в ПЖ у человека.

Таблица 2. Корреляционные взаимоотношения между показателями, характеризующими состояние предстательной железы у пожилых крыс

ВЫВОДЫ

1. Для создания экспериментальной модели ДГПЖ с помощью многократного введения сульпирида необходимо использовать крыс старше 10 мес. В нашем исследовании у крыс 16-18-месячного возраста модель была воспроизведена в 100% случаев.

2. Через 10 дней после 30-дневного курса сульпирида в предстательной железе пожилых крыс регистрируются выраженные морфологические признаки доброкачественной гиперплазии.

3. Механизмами развития ДГПЖ под влиянием сульпирида являются усиленная пролиферация и внутриклеточная гипертрофия клеток железистого эпителия.

4. Одновременно с развитием гиперплазии в эпителиальных клетках ацинусов предстательной железы активируются механизмы апоптоза, что свидетельствует об обратимости данной экспериментальной патологии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ткачук В.Н. Современные представления об этиологии и патогенезе доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Нефрология 2004; 8(2): 90-93.

2. Тиктинский О.Л., Калинина С.Н. Заболевания предстательной железы. СПб.: Питер. 2006. 464 с.

3. Боровская Т.Г., Фомина Т.И., Дурнев А.Д., Удут В.В., Пахомова А.В., Юрмазов З.А., Дыгай А.И. Методические рекомендации по доклиническому изучению простатотропной активности лекарственных средств. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: ФГБУ "НЦэМсП" Минздравсоцразвития России. 2012. С. 727-739.

4. Лесовая Е.А., Кирсанов К.И., Антошина Е.Е. Моделирование доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии 2013;(12):55-64.

5. Беспалов В.Г., Муразов Я.Г., Кужанов АА., Семенов А.Л. Сравнительное изучение простатот-ропных эффектов хвойного провитаминного концентрата и экстракта Serenoa repens на модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы у крыс. Экспериментальная и клиническая урология 2013;(2):30-34.

6. Van Coppenole F., Slomianny C., Carpentier F. Effects of hyperprolactinemia on rat prostate growth: evidence of androgeno-dependence. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001;280( 1): 120-129.

7. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М. «Медицина». 1990. 384 с.

8. Кудрявцев Ю.В., Сивков А.В. Морфологические изменения в ткани предстательной железы при доброкачественной гиперплазии. Экспериментальная и клиническая урология2010;(1):18-22.

9. Цветков И.С., Макарова О.В., Мхитаров В.А. Структурно-функциональная характеристика предстательной железы крыс. Клиническая и экспериментальная морфология 2013;(4): 69-74.

10. Nilsson S, Nordgren H, Karlberg L, Harvig B, Busch C, Hall T, Bjork P. Expression of estramus-tine-binding protein (EMBP) and the proliferation associated antigen Ki-67 in prostatic carcinomas. Scand J Urol Nephrol 1988;110:31-37.

11. Theodoropoulos V. E., Tsigka A., Mihalopoulou A., Tsoukala V., Lazaris A.C., Patsouris E., Ghikonti I. Evaluation of neuroendocrine staining and androgen receptor expression in incidental prostatic adenocarcinoma: prognostic implications. Urology 2005;66(4) :897-902.

12. Ковылина М.В., Прилепская Е.А., Сергейко И.П., Моисеенко Т.Н., Колонтарев К.Б., Говоров А.В., Пушкарь Д.Ю. Прогностическое значение иммуногистохимических маркеров Ki-67 p53 после радикальной простатэктомии. Онкоурология 2014;(1): 49-52.

13. Попков В.М. Прогностическое значение молекулярных маркеров при опухолях предстательной железы. Медицинская наука и образование Урала 20Ю;11(2):30-34.

14. Ходченкова И.П., Зарубина И.В., Шабанов П.Д. Метаболические изменения в предстательной железе и иммунный статус крыс при доброкачественной гиперплазии. Психофармакология и биологическая наркология 2005 ;5(4):1081-1085.

15. Самуилов В.Д. Биохимия программируемуей клеточной смерти (апоптоза) у животных. Соросовский образовательный журнал 2001;7(10):18-25