Экспериментальная оценка новых технологий профилактики и лечения почечной недостаточности

Острая почечная недостаточность (ОПН) является тяжелым патологическим состоянием, часто сопровождающим хронические заболевания верхних и нижних мочевых путей. Профилактика и лечение этого осложнения до настоящего времени остается серьезной проблемой, так как, несмотря на многолетние исследования, эффективность медикаментозного лечения остается не столь высокой [1, 2]. Современные технологии, использующие новые возможности биологии и медицины, открывают новые перспективы в этом направлении.

В данной работе рассматриваются два перспективных направления в предупреждении и лечении нарушения функции почек: использование нового класса антиоксидантов, избирательно накапливающихся в митохондриях, и клеточных технологий, способных активизировать регенераторный потенциал функционально активных структур органа.

Одним из основных факторов развития как постишемической, так и токсической форм ОПН является лавинообразное усиление продукции активных форм кислорода (АФК), приводящее к окислению и деструкции липидной основы клеточных мембран, индукции избыточного синтеза оксида азота с образованием чрезвычайно токсичного для клеток пероксинитрита и другим негативным последствиям, ведущим к повреждению клеток паренхимы почки и потере ее функциональной полноценности. Патогенетически оправданная терапия традиционными антиоксидантами не оказывает желаемого эффекта из-за того, что не удается создать в клетке достаточно высокую концентрацию антиоксидантов вследствие разрушения ферментными системами печени и/или недостаточно широким терапевтическим диапазоном концентраций препарата [3]. Открытие класса соединений, способных проникать через клеточную мембрану и избирательно накапливаться в митохондриях, создало новые возможности антиоксидантной терапии острого нарушения функции органов, в том числе острой почечной недостаточности [3, 4].

В НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова был синтезирован ряд таких соединений на основе трифенилметилфосфония, 2 из которых (условно названные SkQ1 и SkQR) в модельных опытах показали высокую способность избирательно накапливаться в митохондриях в концентрациях, превышающих их концентрацию в окружающей среде в 1000 раз, и оказывать выраженное антиоксидантное действие [3]. В опытах на культуре почечных клеток эти препараты эффективно предупреждали гибель клеток от окислительного стресса и гипоксии [5].

Другим новым направлением в профилактике и терапии почечной недостаточности, привлекающим пристальное внимание исследователей, является использование клеточных технологий, в частности терапии стволовыми клетками. В мировой и отечественной литературе показано, что гемопоэтические и мезенхимальные (стромальные) стволовые клетки костного мозга принимают участие в регенерации поврежденных почечных структур, а экзогенное введение этих клеток как непосредственно в почку, так и в системный кровоток ускоряют восстановление нарушенной функции этого органа [6-9]. Имеются сведения и о возможном наличии в самой почке резидентных стволовых клеток, также способных участвовать в регенерации компонентов почечной паренхимы [10].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Нами изучены возможности применения новых технологий митохондриально ориентированных антиоксидантов и клеточной терапии для профилактики развития ОПН в эксперименте.

Использование митохондриально ориентированных антиоксидантов. Эффективность применения двух препаратов SkQ1 и SkQR была изучена на модели острой постишемической почечной недостаточности, которую вызывали у крыс путем пережатия сосудистой ножки левой почки на 90 минут с одновременной кон тралатеральной нефрэктомией. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозе 0,2 или 1 мкмоль на крысу за 24 часа до ишемического воздействия. Распределение препарата SkQR в почке изучали через 1, 3, 24 и 72 часа после введения с помощью лазерной конфокальной микроскопии витальных срезов на аппарате LSM 510 фирмы Karl Zeiss (ФРГ). Определение способности SkQR ингибировать продукцию АФК оценивали с помощью конфокальной микроскопии срезов почки, окрашенных флуоресцентным зондом дихлорфлуоресцеином (DCF), проявляющим свечение при взаимодействии с АФК. Противоишемическую эффективность SkQR сравнивали с эффективностью комплекса препаратов а-токоферол + пентоксифиллин. а-токоферол вводили двукратно в дозе 50 мг/кг за 24 и 3 часа до ишемического воздействия, а пентоксифиллин в дозе 5 мг/кг.

Клеточная терапия. В эксперименте изучено влияние 2-х типов стволовых клеток, полученных из аутопсийного материала плодов человека 16-18 недель гестации культивированных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток (КМ-МСК) и суммарной культуры плодных почечных клеток (КПК) при острой постишемической почечной недостаточности (ОПН).

Забор и культивирование материала проводился в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова в соответствии с разработанными методиками [11]. КМ-МСК и КПК в количестве 106 клеток, суспендированных в 0,1 мл физиологического раствора, вводили пункционно в корковое вещество почки, ишемизированной в течение 90 минут, или в нижнюю полую вену сразу же после восстановления почечного кровотока. Распределение введенных клеток изучали через 1 и 7 суток после инъекции в почку КМ-МСК, меченных флуоресцентным зондом Calcein AM.

Для определения влияния антиоксидантной и клеточной терапии на функциональное состояние ишемизированной почки крыс периодически помещали в обменные клетки на 24 часа для сбора мочи и брались образцы крови из хвостовой вены. Биохимические параметры крови и мочи определяли на автоматическом анализаторе ADVIA-2000 (США).

Гистологическое исследование ишемизированных почек осуществляли по стандартной методике с окрашиванием парафиновых срезов гематоксилином и эозином.

Статистическую обработка цифровых данных проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6.0, используя непараметрические методы анализа для малой выборки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты использованиямитохондриально ориентированных антиоксидантов. В предварительных экспериментах определялась динамика накопления препаратов в митохондриях клеток интактной почки, с тем, чтобы определить оптимальное время их введения. Для этого использовали препарат SkQR, обладающий свойством спонтанной флуоресценции за счет включенного в состав молекулы родамина. Оказалось, что S при внутрибрюшинном введении 1 мкМ SkQR через 1 час препарат накапливался преимущественно в клубочках, а через 3 часа происходило равномерное окрашивание практически всех почечных канальцев при исчезновении флуоресценции клубочков (рис. 1А и 1Б). Такая же картина была получена через 24 часа после введения препарата. Через 3 суток отмечено снижение концентрации препарата в канальцах нефрона при практически полном отсутствии флуоресценции клубочков (рис. 1В).

А – через 1 час после введения

Б – через 3 часа после введения

В – через 3 суток после введения

Рисунок 1. Динамика накопления SkQR в срезах почки

Таблица 1. Антирадикальное действие SkQR в зависимости от сроков введения препарата

Мы сопоставили динамику накопление SkQR в ткани почки с проявлением его антирадикальной активности. В митохондриях почечных канальцев после ишемического воздействия (40 минут ишемии и 10 минут реперфузии) SkQR максимально ингибировал продукцию АФК, оцененную по интенсивности флуоресценции зонда DCF, при введении препарата за 1 сутки до начала ишемии (ингибирование на 74%). При введении SkQR за более короткий период (6 часов) или более длинный период (3 и 7 суток) ингибирующий эффект был достоверно ниже (таблица 1). Исходя из этих данных, в дальнейших исследованиях вводили изучаемые препараты за 1 сутки до ишемического воздействия.

Другой задачей нашего исследования было изучение эффективности SkQ1 и SkQR в предотвращении развития острой постишемической почечной недостаточности.

В контрольной серии опытов (90 минут ишемии единственной почки) в первые 3 суток умерло от уремии 62% крыс, к 7 суткам летальность составила 82%. В экспериментах с введением 1 мкмоль SkQ1 выживаемость в течение 3 суток после ишемического воздействия составила 90%, а к 7 суткам 80%. В более отдаленные сроки (до 3 недель) количество выживших крыс не изменилось. Выживаемость животных в группе с введением 1 мкмоль SkQR была несколько выше, составив 100% через 3 суток и 90% через 7 суток.

Для более детального сравнения противоишемического действия SkQ1 и SkQR нами проведено исследование основных функциональных показателей ишемизированной почки.

В контрольной серии (ишемия / реперфузия) через 3 суток после ишемии у переживших этот срок крыс в большинстве случаев отмечали увеличение диуреза (таблица 2) и только у некоторых животных он практически не менялся. Увеличение диуреза свидетельствовало о полиурической фазе почечной недостаточности, тогда как низкий диурез, по нашему мнению, свидетельствовал о переходе в олигурическую стадию, то есть о более тяжелой степени повреждения почки. Через 7 суток у 2 выживших животных (из 11) сохранялась полиурическая фаза.

В опытах с защитой почек SkQ1 в раннем постишемическом периоде (3 суток) у всех выживших крыс отмечалась выраженная полиурия, которая сохранялась и к 7-м суткам. В условиях противоишемической защиты SkQR выраженного полиурического эффекта не наблюдали. Диурез был ближе к нормальным значениям, а через 7 суток достоверно не отличался от нормы.

Таблица 2. Влияние предварительного введения SkQ1 и SkQR на функциональное состояние ишемизированных почек

Таблица 3. Сравнительная характеристика противоишемической эффективности SkQR и комплекса а-токоферол + пентоксифиллин

Концентрация мочевины в крови через 3 суток после ишемии значительно повышалась во всех исследованных группах, причем в большей степени в опытах с защитой SkQ1 (табл. 2). Менее выраженное повышение концентрации мочевины крови в контрольной серии опытов по сравнению с экспериментами, где проводили защиту антиоксидантами, можно объяснить тем, что в контроле к 3-м суткам погибали животные с наиболее нарушенными функциональными показателями и выживали более резистентные, у которых азотовыделительная функция нарушалась в меньшей степени. К 7-м суткам концентрация мочевины снижалась во всех группах, причем в большей степени в опытах с SkQR, но оставалась достоверно выше нормы. Концентрация креатинина в крови в контрольной серии опытов через 3 суток после ишемии резко повышалась, превышая норму более чем в 10 раз, и высокие значения этого показателя сохранялись через 7 дней после ишемии. В обеих опытных группах концентрация креатинина в крови повышалась в значительно меньшей степени, а в опытах с противоишемической защитой SkQR через 7 дней после ишемии этот показатель снижался до верхней границы нормы.

Таблица 4. Влияние интрапаренхиматозного введения КПК и КМ-МСК на динамику восстановления функционального состояния почек крыс с постишемической ОПН

Таблица 5. Влияние внутривенного введения фетальных КПК и КМ-МСК на динамику функции почки у крыс
с постишемической ОПН (2-я серия)

Поскольку парциальные функции почек могут нарушатьS ся в разной степени, раздельно оценивались изменение клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина и канальцевой реабсорбции по уровню реабсорбции натрия (таблица 2). В контрольной серии опытов происходило резкое (более чем 5-кратное) снижение клиренса креатинина (в анализ входили только выжившие животные с меньшей степенью повреждения почки, чем у погибших). Через 7 суток значения клиренса креатинина возросли незначительно. В экспериментах с защитой обоими антиоксидантами этот показатель через 3 суток после ишемии снижался достоверно в меньшей степени, а к 7-м суткам существенно возрастал, достоверно превышая контрольные значения.

Канальцевая реабсорбция натрия в контрольной серии опытов через 3 суток резко снижалась, а через 7 суток у 2 выживших животных хотя и возрастала, но оставалась значительно ниже нормы. В опытах с защитой SkQ1 через 3 суток средние значения этого показатели были на субнормальном уровне. Через 7 суток реабсорбция натрия полностью нормализовалась. В экспериментах с SkQR канальцевая реабсорбция не ухудшалась даже в первые 3 суток после ишемии и оставалась в нормальных пределах в последующие сутки.

Для сравнения эффективности применения митохондриально ориентированных антиоксидантов с эффективностью традиционных противоишемических препаратов с антиоксидантным действием в отдельной серии экспериментов изучалась выраженность постишемической острой почечной недостаточности у крыс, которым предварительно вводили SkQR, и у животных защищенных предварительным введением комплекса а-токоферол + пентоксифилин, противоишемическая активность которого была доказана ранее [12, 13]. Оказалось, что, хотя оба варианта защиты предупреждали гибель животных от уремии, SkQR в большей степени предупреждал развитие постишемических функциональных и метаболических расстройств, чем комплекс а-токоферол + пентоксифиллин (таблица 3).

Полученные результаты свидетельствуют, что оба митохондриально ориентированных антиоксиданта (SkQ1 SkQR) оказывают выраженное противоишемическое действие, препятствуют гибели животных от ОПН и способствуют сохранению функциональной активности ишемизированного органа. Эффективность SkQR оказалась несколько выше, чем SkQ1 за счет большего защитного эффекта в отношении сохранности канальцевого аппарата почки, что проявилось в предупреждении нарушения реабсорбции натрия и уменьшении степени полиурии (косвенное свидетельство лучшей сохранности способности концентрировать мочу).

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали достаточно высокую эффективность нового класса антиоксидантов, селективно накапливающихся в митохондриях. Дальнейшие исследования должны быть направлены на их использование для предупреждения нарушений функционального состояния почек в клинической практике.

Результаты применения клеточной терапии. В контрольных опытах все животные после моделирования ОПН погибли при явлениях уремии на 2-4 сутки. В опытах с интрапаренхиматозным введением КПК погибло 83% оперированных крыс. После инъекции КМ-МСК ни одна из крыс не погибла от уремии (только одна из них погибла на 9-е сутки по неизвестной причине при улучшающихся показателях функции почки).

При оценке функционального состояния выживших крыс установлено, что после интрапаренхиматозного введения КПК показатели функционального состояния ишемизированной почки оставались нарушенными до 39-го дня наблюдения (таблица 4). В эти сроки клиренс креатинина и реабсорбция натрия сохранялись на субнормальных значениях. Отмечено, что в опытах с интрапаренхиматозным введением КМ-МСК достоверное улучшение показателей функционального состояния ишемизированной почки отмечалось уже на ранних сроках (с 4-го дня постишемического периода). В более отдаленном периоде функция ишемизированной почки нормализовалась к 20-40 дню. Нормальные показатели сохранялись до 80-х суток (максимальный срок наблюдения).

При внутривенном же введении КПК выживаемость крыс с постишемической ОПН составила 50%, а после введения КММСК 83%. Оценка динамики функциональных показателей состояния почки у выживших крыс этой серии опытов показала, что в опытах с внутривенным введением КПК нормализация функции почки происходила уже через 2 недели после ишемического воздействия, но в последующем функциональные показатели несколько ухудшались и в отдаленные сроки находились на субнормальных значениях, за исключением реабсорбции натрия. После введения КМ-МСК функция почки постепенно улучшалась, но в отдаленные сроки также не достигала нормы, за исключением канальцевой реабсорбции натрия (таблица 5).

Сравнительное гистологическое исследование почек через 3 суток после ишемического воздействия показало, что в контрольных группах происходит выраженное повреждение канальцевого аппарата почки, проявляющееся массивной гидропической дистрофией эпителиоцитов с явлениями колликвационного некроза и некробиоза отдельных групп эпителиоцитов (рисунок 2А). Просвет многих канальцев был полностью заполнен эозинофильным содержимым (гиалиновые цилиндры) (рисунок 2Б). После введения КМ-МСК (у погибшей группы крыс) выраженность гидропической дистрофии эпителиоцитов была значительно меньше, некроз и некробиоз эпителиальной выстилки канальцев не отмечены. Констатировано S выраженное полнокровие перитубулярных капилляров, свидетельствующее об интенсификации органной микроциркуляции (рисунок 2В).

А – Контроль. Выраженная гидропическая

Б – Контроль. Просвет канальцев полностью

В – Введение КМ-МСК. Умеренно выраженная

Рисунок 2. Гистологическая картина почек крыс через 3-е суток после ишемического воздействия. Окраска гематоксилином и эозином. Х 200

Для уточнения судьбы пересаженных стволовых клеток в части опытов проведено инъецирование в почку КМ-МСК, меченных флуоресцентным красителем Calcein AM. При исследовании срезов почки через 1 сутки выявлялось наличие меченых КМ-МСК в месте инъекции и в прилежащих областях, причем все меченые клетки располагались в интерстиции (рисунок 3А). Через 7 суток количество меченых клеток уменьшилось, но они по-прежнему выявлялись в интерстиции почки даже на отдаленном расстоянии от места введения (рисунок 3Б).

Рисунок 3. Распределение введенных КМ-МСК, меченых Calcein AM (зеленая окраска), в интерстиции почки крысы через 1 сутки (А) и через 7 суток (Б) после введения

Таким образом, терапевтическая эффективность разных видов клеток при ОПН оказалась различной и зависела от способа введения. Введение КМ-МСК предотвращало необратимое постишемическое повреждение почек и способствовало более быстрому восстановлению функциональной полноценности органа как при внутрипочечном, так и при внутривенном пути введения, тогда как введение КПК оказывало положительный эффект лишь при введении в системный кровоток. При этом функция органа восстанавливалась более полноценно. По-видимому, терапевтический эффект введенных клеток связан главным образом с паракринным их влиянием, реализующимся через выделение комплекса цитокинов и факторов роста, способствующих усилению микроциркуляции в почке и уменьшению повреждения канальцевого эпителия в раннем постишемическом периоде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований по внедрению новых технологий в арсенал лечебных мероприятий тяжелых острых и хронических нарушений функции почек, часто сопровождающих урологические заболевания. Направленная на митохондрии антиоксидантная терапия и применение стволовых клеток позволяют предупредить необратимое повреждение почек, улучшить их функциональное состояние и избежать летальных осложнений. Такой подход открывает новые перспективы терапевтических возможностей в современной урологии.

Ключевые слова: почечная недостаточность, ОПН, стволовые клетки, антиоксиданты.

ЛИТЕРАТУРА

1. Шумаков В.И. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2005. № 3. С. 6-9.
2. DuBose T.D.Jr.,Warnock D.G., Mehta R.L., Bonventre J.V., Hammerman M.R., Molitoris B.A., Paller M.S., Siegel N.J., Scherbenske J., Striker G.E. // Am. J. Kidney Dis. 1997. Vol. 29. P. 793-799.
3. Скулачев В.П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения: «мегапроект» по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы. // Биохимия. 2007. T. 72. Вып. 12. C. 1700-1714.
4. Бакеева Л.Е.. Барсков И.В., Егоров М.В. и др. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных активными формами кислорода (сердечной аритмии, инфаркта миокарда, ишемии почки и инсульта головного мозга). // Биохимия. 2008. T. 73. Вып. 12. C. 1607-1621.
5. Васильева А.К., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Защитное действие ингибиторов GSK-3 и митохондриально-ориентированного антиоксиданта SkQ1 при ишемии/реоксигенации в культуре клеток почки. // Материалы II Международного молодежного медицинского Конгресса, Санкт-Петербург. 2007. C. 45-46.
6. Morigi M., Imberti B., Zoja C. et al. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repare the kidney and improve function in acute renal failure. // J. Am. Soc. Nephrol. 2004. Vol. 5, № 7. P. 1794-1804.
7. Kale S., Karihaloo A, Clark P.L. et al. Bone marrow stem cells contribute to repaire of the ischemically injured renal tubule. // J. Clin. Invest. 2003. Vol. 112. № 1. P. 42-49.
8. Togel F., Hu Z., Weiss K. Et al. Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanism // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2005. Vol.289, N 1. P. F31-F42.
9. Humphries B.D., Bonventre J.V. Mesenchymal stem cells in acute kidney injury. // Annu. Rev. Med. 2008. Vol. 59. P. 11-25.
10. Baud L., Haymann J.P., Bellocq A., Founquerav B. Contribution of stem cells to renal repair after ischemia/reperfusion. // Bull. Acad. Natl. Med. 2005. Vol. 189. № 4. P. 643-644.
11. Мусина Р.А., Бекчанова Е.С., Сухих Г.Т. Сравнение мезенхимальных клеток, полученных из различных тканей человека. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. № 2. C. 89-94.
12. Даренков А.Ф., Яненко Э.К., Казаченко А.В., Борисик В.И. Эффективность противоишемической защиты почки пентоксифиллином и а-токоферолом. // В сб. Экспериментальная урология и нефрология. Общие проблемы патологии. М. 1996. C. 153-163.
13. Казаченко А.В. Диагностика и профилактика ишемического повреждения почек при оперативном лечении коралловидного нефролитиаза (экспериментально-клиническое исследование). / Дисс. канд. мед. наук. М. 1996.