Анализ микроделеций AZF локуса Y хромосомы у мужчин c бесплодием

В современном мире бесплодие представляет собой важную медико-социальную проблему, затрагивающую демографические основы общества. Бесплодием страдают около 15% супружеских пар, при этом, неуклонно растет доля мужского фактора и по данным Европейской ассоциации урологов она в настоящее время составляет около 50% [1]. Приблизительно у 5% мужчин репродуктивного возраста имеются различные количественные и качественные изменения спермы. Около 1/3 случаев мужского бесплодия относят к так называемому идиопатическому типу бесплодия, большинство случаев которого может быть обусловлено генетическими факторами, такими как различные нарушения хромосом или мутации в ответственных за сперматогенез генах [2,3].

Результаты многочисленных исследований, посвященных изучению роли генетических факторов в этиологии бесплодия, убедительно доказывают ведущее место данных факторов в структуре нарушений репродуктивной функции как у мужчин, так и у женщин [4,5]. Так, генетические факторы обуславливают, по крайней мере, 30-50% всех случаев тяжелых форм бесплодия у мужчин. Помимо аномалий кариотипа наиболее частой генетической причиной бесплодия у мужчин являются делеции Y-хромосомы, захватывающие локус AZF. Распространенность данной мутации среди мужчин с выраженными отклонениями в показателях спермограммы широко варьирует в различных популяциях и составляет в среднем 7,6% [6,7].

Делеции AZF-локуса связаны с различной степенью нарушения сперматогенеза от умеренного снижения его активности (гипосперматогенез) или блока сперматогенеза до практически полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах – Сертоли клеточный синдром (СКС) [4-6, 8-12].

Азооспермия и олигозооспермия тяжелой степени являются одними из наиболее тяжелых форм нарушения сперматогенеза и составляют 10-20% и 15-20%, соответственно, от всех нарушений репродуктивной функции у мужчин при измененных показателях спермограммы. С помощью имеющихся в настоящее время методов цитогенетической и молекулярно-генетической диагностики макро- и микроделеции Y-хромосомы, захватывающие локус AZF, удается обнаружить у 10-15% мужчин с азооспермией и у 5-10% мужчин с олигозооспермией тяжелой степени [5-8,11-15].

Впервые роль делеций локуса Yq11 в этиологии нарушения сперматогенеза и бесплодия у мужчин была показана в 1976 г. L. Tiepolo и O. Zuffardi [16]. Дальнейшие цитогенетические и молекулярно-генетические исследования позволили с помощью STS-технологии (sequencetagged sites) построить детальную карту Y-хромосомы, включающую 43 делеционных интервала [17]. Было подтверждено наличие в дистальной части длинного плеча Yхромосомы локуса AZF, делеции которого ответственны за нарушение сперматогенеза. В 1996 г. P.H. Vogt и соавт. на основе полученных данных о локализации и размере делеций, выявленных у 26 мужчин, предложили выделить в локусе Yq11.21-q11.23 три неперекрывающихся субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc [18].

Целью нашего исследования явилось уточнение структуры и определение роли генетических нарушений при бесплодии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

За период с 2017 по 2018 гг. было обследовано 63 пациента с первичным бесплодием. На основании результатов спермиологического исследования мужчин с бесплодием разделили на 2 группы: группу с азооспермией и контрольную группу (табл. 1). В группу с азооспермией были включены 63 пациента, контрольную группу составили 30 здоровых (фертильных) мужчин.

Обследование, проведенное пациентам, включало общеклиническое, общее и специальное андрологическое исследование, сперматологическое (стандартное спермиологическое исследование, в некоторых случаях – гистологическое исследование биоптата яичка), молекулярно-генетическое исследование (анализ микроделеций Y-хромосомы).

Спермиологический анализ эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ [19]. Гистологическое исследование биоптата яичка проводилось путем цитогистологического анализа [9].

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) выполняли на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием Taq-полимераз.

Анализ микроделеций локуса AZF был проведен в соответствии с руководством по молекулярной диагностике микроделеций Y-хромосомы [12]. Для обнаружения делеций применяли мультиплексную амплификацию (МПА), предложенную в данном руководстве в собственной модификации. На первом этапе анализа выполняли детектирование делеций в трех субрегионах AZF.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среди 63 обследованных мужчин кыргызов с бесплодием делеции локуса AZF были обнаружены у 7 (11,1%) пациентов (табл. 1). Делеции Y-хромосомы были выявлены только у пациентов с азооспермией. Ни одной Y-делеции не было обнаружено у фертильных мужчин контрольной группы. Чаще всего делеции располагались в AZFc-субрегионе (57,1% делеций Y-хромосомы) (табл. 2). Микроделеции субрегиона AZFb были выявлены только у двух пациентов (28,6 % случаев от всех обнаруженных делеций локуса AZF) и у одного пациента выявлена микроделеция AZFa+b+c – субрегиона (14,3% случаев).

Таблица 1. Частота делеций локуса AZF в обследованных группах мужчин

Таблица 2. Количество обнаруженных микроделеций AZF локуса длинного плеча Y-хромосомы

Спермиологическая и гистологическая картина, обнаруженная нами у мужчин с делециями локуса AZF, выявляла различную степень нарушений сперматогенеза. У обоих пациентов с микроделециями AZFbсубрегиона отмечали азооспермию. Гистологическое исследование биоптата яичка, проведенное у одного из них, позволило выявить синдром клеток Сертоли. По результатам молекулярного анализа у этих пациентов область делеции захватывала маркер sY1197 субрегиона AZFb. У мужчин с делециями субрегиона AZFc сперматозоиды отсутствовали (азооспермия). При анализе гистопрепаратов биоптата яичка, выполненного у двух из этих пациентов, было установлено, что у одного из них половые клетки отсутствовали в большинстве семенных канальцев.

ОБСУЖДЕНИЕ

Частота обнаружения микроделеций Y-хромосомы среди мужчин с бесплодием значительно варьирует в различных исследованиях (от 1% до 35%) [7,8,10,20]. Широкий разброс частот выявляемости делеций обусловлен влиянием ряда факторов, среди которых наибольшее значение имеют критерии отбора пациентов для проведения микроделеционного анализа. В среднем выявлено наличие делеций локуса AZF у 7,5% мужчин с бесплодием, при этом наибольшая частота делеций отмечена среди мужчин с идиопатической азооспермией (18%) или тяжелой олигозооспермией неясного генеза (14,3%) [9]. Количество делеций, выявленных по результатам нашего исследования, в общем аналогично частоте встречаемости делеций отдельных субрегионов или захватывающих несколько регионов, а также аналогично средней частоте встречаемости микроделеций в азиатских популяциях [20]. При этом соотношение между различными типами выявленных нами делеций в целом отражает структуру делеционных нарушений в локусе AZF у мужчин с бесплодием.

При делециях, захватывающих субрегионы AZFb и AZFc, у мужчин выявляются азооспермия и СКС. Определение зависимости степени нарушения сперматогенеза от размера и локализации делеций может иметь прогностическое значение для возможного получения сперматозоидов, пригодных для проведения ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection) – инъекцией сперматозоида в цитоплазму ооцита [5,8,11]. Наличие делеций, захватывающих субрегионы AZFa или AZFb, указывает на невозможность получения зрелых половых клеток, а у пациентов с делециями AZFc при биопсии яичка примерно в 50-70 % случаев удается получить зрелые сперматозоиды [5,11].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты многочисленных исследований микроделеций Y-хромосомы у мужчин с бесплодием, а также оценка роли генов локуса AZF в дифференцировке и развитии мужских половых клеток убедительно свидетельствуют о высокой значимости генов Y-хромосомы в контроле сперматогенеза у человека. У специалистов в области генетики, андрологии, репродуктивной медицины произошло осознание того, что азооспермия является одной из наиболее распространенных причин бесплодия у мужчин, и исследование микроделеций Y-хромосомы широко вошло в практику. Молекулярно-генетический анализ Y-хромосомы на наличие классических микроделеций должен быть рекомендован всем мужчинам с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени.

Исследование микроделеций AZF локуса Y-хромосомы у мужчин с тяжелой формой олигозооспермии и азооспермии позволяет установить генетическую причину нарушения сперматогенеза и является важным диагностическим и прогностическим критерием, определяющим рациональную тактику лечения, выбор метода преодоления бесплодия, а также прогнозировать вероятность получения сперматозоидов для проведения экстракорпорального оплодотворения, в частности интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит.

ЛИТЕРАТУРА

1. Jungwirth A, Giwercman A, Tournaye H, Diemer T, Kopa Z, Dohle G, et al. Guidelines on Male Infertility. Eur Assoc Urol 2012; 62 (2): 324-332. DOI: 10.1016/j.eururo.2012.04.048
2. Krausz C, Forti G, McElreavey K. The Y chromosome and male fertility and infertility. Int J of Androl 2003;26(2):70-75. DOI:10.1046/ j.1365-2605.2003.00402.x
3. Reijo R, Lee TY, Salo P, Alagappan R, Brown LG, Rosenberg M, et al. Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nat Genet 1995;10(4):383-93. DOI: 10.1038/ng0895-383
4. Гоголевский П.А., Гоголевская И.К. Y- хромосома имужское бесплодие (обзор литературы). Проблемы репродукции 1999; 5 (5): 26-34.
5. Черных В.Б., Курило Л.Ф., Поляков А.В. Y-хромосома, AZF-микроделеции и идиопатическое бесплодие у мужчин, Проблемы репродукции. 2001, 5 (7): 47-58.
6. Choi J, Song SH, Bak CW, Sung SR, Yoon TK, Lee DR, et al. Impaired spermatogenesis and gr/gr deletions related to Y chromosome haplogroups in Korean men. PLoS One 2013; 7(8): e43550. DOI:10.1371/journal.pone.0043550
7. Ferlin A, Moro E, Rossi A, Foresta C, Rossato M, Garolla A, et al. Role of the AZFa candidate genes in male infertility. J of Endocr Invest 2000; 23(10): 646-651. DOI: 10.1007/bf03343788
8. Беляева Н. А., Глинкина Ж. И., Калинина Е. А. Современные аспекты и проблемы мужского бесплодия, ассоциированного с мутацией AZF локуса хромосомы Y. Акушерство и гинекология 2012; 8(2): 21-27.
9. Черных В.Б., Курило Л.Ф., Гоголевская И.К. Комплексное клинико-генетическое обследованиепациентов с азооспермией или олигозооспермией неясной этиологии. Проблемы репродукции 2001, 3 (7): 58-63.
10. Foresta C, Moro E, Ferlin A. Y chromosome microdeletions and alterations ofspermatogenesis. Endocr Rev 2001; 22(2):226-239. DOI:10.1210/ edrv.22.2.0425
11. Krausz C, Quintana-Murci L, McElreavey K. Prognostic value of Y deletion analysis: what is the clinical prognostic value of Y chromosome microdeletion analysis. Hum Reprod 2000;5(7):1431-1434. DOI:10.1093/ humrep/15.7.1431
12. Simoni M, Bakker E, Eurlings M, Matthijs, Moro, Muller, et al. Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletion. Int J Androl 1999; 22(5):292-299. DOI:10.1046/j.1365-2605.1999.00193.x
13. Зобкова Г.Ю., Баранова Е.Е., Донников А.Е., Мсхалая Г.Ж., Залетова В.В., Кошкина Т.Е., Трофимов Д.Ю. Спектр делеции фактора азооспермии (AZF) у мужчин с нормальным и нарушенным сперматогенезом. Проблемы репродукции 2017; 23(4): 109-113.
14. Волков А.Н., Цуркан Е.В. PTsR-диагностика AZF-микроделеции при установлении генетических причин мужского бесплодия. Медицина в Кузбассе 2016; 3: 23-27.
15. Здановский В. М., Гоголевский П. А., Гоголевская И.К. Тестирование микроделеций на Y-хромосоме у пациентов с различными нарушениями сперматогенеза. Проблемы репродукции 2000; 6(6): 56-59.
16. Tiepolo L, Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the non fluorescent portion of the human Y chromosome long arm. Hum Genet 1976; 34(2):119-124. DOI:10.1007/bf00278879
17. Vollrath D, Foote S, Hilton A, Brown L, Beer-Romero P, Bogan J et al. The human Y chromosome: a 43-internal map based on naturally occurring deletions. Science 1992 Oct; 258 (5079): 52-59. DOI:10.1126/science.1439769
18. Vogt PH, Edelmann A, Hirschmann P, Kohler MR. The azoospermia factor (AZF) of the human Y chromosome in Yq11: function and analysis in spermatogenesis. Hum Mol Gene 1996;5(7): 933-943. DOI:10.1071/rd9950685
19. WHO (1999). Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. Четвертое издание. Cambridge University Press, 1999. Пер. с англ. Р.А. Нерсесяна. Научн. ред. перевода проф. Л. Ф. Курило. М. 2001, 143 с.
20. WangRX, FuC,YangYP,HanRR,DongY,DaiRL, et al.Male infertility inChina: laboratory finding for AZF microdeletions and chromosomal abnormalities in infertile men from NortheasternChina.JAssist ReprodGenet 2010; 27(7): 391–396. DOI: 10.1007/s10815-010-9420-9