Mоделирование хронического простатита (ХП) занимает важное место как в решении задач разработки информативных методов диагностики, так и высокоэффективного лечения. Исходя из понимания особенностей формирования патологии предстательной железы (ПЖ) как следствия сложных фазовых процессов в организме на всех уровнях его структурной организации, становится совершенно очевидной необходимость изучения указанной патологии с системных позиций и использование достижений фундаментальных наук, в частности, физики поверхностей и жидких кристаллов. Тем более что именно соединениям со свойствами жидких кристаллов, входящих в состав лецитиновых зерен сока ПЖ, присуща высокая оптическая активность, в частности, в виде способности к двойному лучепреломлению в виде высвечивания как основе метода поляризованной флуоресценции.
Цитотоксическое повреждение отдельных органов и тканей обычно связывают с протеолизом, как одним из проявлений патохимической фазы иммунопатологического процесса. При этом в поврежденных клетках происходит процесс биохимической деградации органических веществ (белков, жиров, углеводородов, нуклеиновых кислот и тому подобное) с образованием многочисленных, токсичных для живого организма, продуктов, так на-зываемых DAMPs (damage-associated molecular patterns) [1-3]. К ним относятся молекулы мышечного белка миозина, цитокины, органические кислоты, в частности, молочная, пировиноградная, мочевая, аминокислоты, фенольные соединения, например, индол, скатол, крезол, фенол, токсичные амины (кадаверин, путресцин), свободные радикалы и продукты липопероксидации. Протеолитическая активность нейтрофильных гранулоцитов при этом существенно усиливает сложный многокомпонентный механизм воспаления: лейкоцитоз, появление в крови С-реактивного белка, увеличение содержимого серкогликоидов, программируемая смерть клеток и тому подобное — все это проявления реакции на избыточное образование DAMPs [4-6]. Неслучайно отмечается повышенный интерес исследователей к изучению патогенного действия токсичных продуктов распада тканей, которое относят к генетически детерминированным механизмам адаптации высокоорганизованного многоклеточного организма к повреждению как таковому. читывая вышеизложенное, большой интерес вызывает роль цитотоксических факторов в формировании ХП, учитывая связь между возникновением данного заболевания и токсичным влиянием на организм.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить влияние токсичных продуктов распада тканей и индуцируемых ими цитотоксических механизмов в развитии поражения ПЖ в эксперименте.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальная часть работы была выполнена на 78 половозрелых крысах-самцах, 16 из которых были контрольной группой (интактные). Масса тела животных составляла от 190 до 245 г. ХП вызывался кастрацией и последующим подкожным введением тестостерона в течение 21 дня в дозе 0,1 мг/кг. Дважды с интервалом в 3 дня им подкожно вводили стандартизированный токсичный экстракт (ТЭ) термически обработанной ксенокожи свиньи в дозе 1мл/кг [8, 9].
Рис. 1. Измельченный субстрат криолиофилизованной кожи свиньи
Вышеуказанную токсичную субстанцию получали следующим образом. Измельченный субстрат ксенокожи свиньи (рис. 1) выдерживали в сухожаровом шкафу при 350OС в течение 90 мин, в результате чего субстрат приобретал своеобразный светлокоричневый цвет (рис.2). Токсичность его возникала в результате декарбоксилирования α-аминокислот и разрушения всех пептидных связей белковых макромолекул при высокотермической обработке с образованием первичных алифатических аминов. К 10 г термически обработанного субстрата добавляли 60 мл дистиллированной воды и выдерживали при 20OС на протяжении 4 ч, после чего центрифугировали при 1500 об.мин–1 в течение 30 мин. Полученную в сверхосадке токсичную субстанцию стандартизировали по содержанию аминов до уровня 10 г/л.
Экспериментальные животные наблюдались ежедневно: оценивалось их общее состояние, двигательная активность. Все исследуемые животные содержались на общепринятом рационе вивария Тернопольского государственного медицинского университета. После завершения эксперименгтальной части подопытных животных под эфирным наркозом выводили с эксперимента (согласно регламентированным Правилам использования лабораторных животных), отбирая в качестве материала для исследования периферическую кровь и ткань ПЖ.
Спектральный анализ поляризуемой флуоресценции нативного биоматериала от животных (изолированные лейкоциты крови и кристаллы сока ПЖ) осуществляли с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ 8-3М, оснащенного фотоэлектронной насадкой ФМЭЛ-1, которая содержит набор интерференционных светофильтров для выявления узких спектральных диапазонов, а также поляризационного микроскопа МС-200 с програмным обеспечением ("Sumy Electron Optics", Украина).
О развитии экспериментальной модели ХП судили по критериям глубины морфологических изменений в ткани ПЖ: уровню лейкоцитолиза и характеру поляризуемой флуоресценции кристаллов сока железы в отпечатке на предметном стекле [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате инкубации изолированных лейкоцитов периферической крови интактных крыс с ТЭ in vitro отмечена выраженная реакция лейкоци-толиза с деструкцией клеток, кариолизис в лимфоцитах (рис. 3).
При исследовании нативной крови подопытных животных на фоне воспроизведенного в эксперименте ХП (рис. 4) были выявлены аналогичные процессы лейкоцитолиза с той лишь разницей, что спектр вторичной люминесценции лейкоцитов в данном случае характеризовался большей длиной волны с одновременным снижением интенсивности свечения.
Рис. 2. Ксенокожа свиньи после термической обработки
Рис. 3. Реакция лейкоцитолиза in vitro под воздействием токсичного экстракта у интактных крыс
Рис. 4. Реакция лейкоцитолиза in vitro после повторного введения токсичного экстракта у кастрированных крыс
Последнее, на наш взгляд, является достаточно убедительным свидетельством интоксикации организма, связанной с влиянием ТЭ, в условиях экспериментального воспроизведения патологического процесса в предстательной железе.
Доказательством этого является и картина патогистологических изменений в предстательной железе. Проведенные гистологические исследования установили перидуктальную и периацинозную лейкоцитарную инфильтрацию стромальной междолевой ткани простаты. Наблюдается значительное уменьшение просветов части выводных протоков, деструктивные изменения выстилающего их эпителия (рис. 5). Нарушение оттока простатического секрета приводит к увеличению размеров и деформации ПЖ, изменениям формы ацинусов секреторных отделов со значительным накоплением секрета в их просвете. Отмечается плоскоклеточная метаплазия секреторного эпителия ацинусов (рис. 6).
Также выявлен фиброз некоторых отделов предстательной железы и дистрофичные изменения ацинусов. Разрастание соединительной ткани сопровождалось значительными изменениями сосудистой системы органа. Отмечено утолщение стенки артерий и артериол, кровенаполнение просветов всех сосудов и, особенно, венул и вен (рис. 7).
Кроме того, убедительным доказательством токсического действия ТЭ на ПЖ и развитие ХП являются результаты исследования поляризуемой флуоресценции кристаллов сока предстательной железы. Относительно мелкие неправильной формы кристаллы сока ПЖ при развитии ХП в условиях избыточной концентрации тестостерона (рис. 8) заметно увеличиваются в размере в условиях потенцирования экспериментального патологического процесса в железе токсичным факто-ром (рис. 9). Для сока предстательной железы интактного животного характерными являются лецитиновые зерна примерно одинакового размера (в пределах 2-3 мкм), в то время как в условиях хронического воспаления размеры зерен увеличиваются до 5-6 мкм с характерными изменениями формы кристаллов преимущественно в виде мальтийского креста. Учитывая анизотропные свойства липидных компонентов сока предстательной железы, являющиеся физической основой их жидкокристаллических характеристик, изменение размеров кристаллов и характера их поляризуемой флуоресценции доказывает системный характер формирования указанного патологического процесса, реализация которого осуществляется как на уровне целостного организма, так и на клеточно-молекулярном и субмолекулярном уровнях. Вышеописанный феномен приобретает роль высокочувствительного информативного теста для решения задач диагностически-прогностического направления, а также для оценки эффективности новых средств и способов лечения хронического воспалительного процесса в предстательной железе.
Рис. 5. Гистологические изменения предстательной железы при моделировании ХП в эксперименте. Склеротические изменения выводных протоков. Значительная лейкоцитарная инфильтрация стромы. Окраска гематоксилином и эозином х 200
Рис. 6. Гистологические изменения предстательной железы при моделировании ХП в
эксперименте. Гипертрофированные конечные секреторные отделы заполнены секретом, уплощенный железистый эпителий.
Окраска гематоксилином и эозином х 200
Рис. 7. Гистологические изменения предстательной железы при моделировании ХП в эксперименте. Разрастание соединительной ткани, измененные сосуды микроциркуляторного русла. Окраска гематоксилином и эозином х 200
Рис.8. Поляризованная флуоресценсия кристаллов сока предстательной железы при ХП без дополнительного введения ТЭ
Рис. 9. Увеличенные кристаллы сока предстательной железы при ХП и ДГПЖ у животных с введенным ТЭ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Применение термоденатурированного токсического субстрата ксеногенной кожи свиньи в качестве индуктора хронического простатита показало высокую воспроизводимость и стандартизацию моделируемого патологического процесса.
Особенности поляризованной флуоресценции компонентов сока ПЖ являются высокоинформативным тестом для оценки ее структурно-функционального состояния и могут быть использованы в качестве клиникодиагностического и прогностического критерия.
ЛИТЕРАТУРА
- Majno G, La Gattuta M, Thompson TE. Cellular death and necrosis: chemical, physical and morphologic changes in rat liver. // Virchows Arch Pathol Anat Physiol Klin Med. 1960. Vol. 333. Р. 421-465.
- Romson J L, Hook BG, Kunkel SL. Reduction of the extent of ischemic myocardial injury by neutrophil depletion in the dog. // Circulation. 1983. Vol. 67. P. 1016-1023.
- Jaeschke H, Hasegawa T. Role of neutrophils in acute inflammatory liver injury. // Liver Int. 2006. Vol. 26. P. 912-919. 4. Копо H, Rock KL. How dying cells alert the immune system to danger. // Nat Rev Immunol. 2008. Vol.
- P. 279-289. 5. Rock KL, Kono H. The inflammatory response to cell death. //Annu Rev Pathol. 2008. Vol. 3. P. 99-126. 6. Lotze MT. The grateful dead: damage-associated molecular pattern molecules and reduction/oxidation regulate immunity.// Immunol Rev. 2007. Vol. 220. P. 60-81.
- Kos FJ, Engleman EG. Requirement for natural killer cells in the induction of cytotoxic Tails. // J Immunol. 1995. Vol. 155. P. 578-584.
- Пат. 63156 U. Способ моделирования хронического простатита с доброкачественной гиперплазией предстательной железы / Хорош В.Я. № U200103758; 30.08.2010; опубл. 25.02.2011, Бюл. № 4/2011.
- Пат. 62894 U. Способ моделирования цитотоксического действия термически поврежденной биологической ткани / Хорош В.Я., Подручная С.Р. № U200100052; 04.01.2011; опубл. 26.09.2011, Бюл. № 18/2011.
- Пат. 57466 U. Способ люминесцентного анализа / Хорош В.Я., Демяненко В.В. № U201010471; 04.01.2011; опубл. 26.09.2011, Бюл. № 18/2011.
