ВВЕДЕНИЕ

Мочекаменная болезнь (МКБ) – древнейшее и широко распространенное заболевание, патогенез которого доподлинно не изучен [1-4]. В настоящее время описаны три его механизма: появление камней над «белыми» интерстициальными гидроксиапатитными бляшками или бляшками Рэндалла, их образование над «заглушками» (пробками) протоков Беллини и постепенный рост уролита в «свободном» растворе из осадка мочи [5]. Золотым стандартом лечения крупных и коралловидных конкрементов остается перкутанная нефролитотрипсия, во время которой, порой, вместо камня в лоханке обнаруживается субстанция белого цвета, принимаемая за фибрин или гной. Неоднократно столкнувшись с подобной ситуацией при удалении «мягких», плотностью 300-400 HU, уролитов, мы провели физикохимический анализ этого субстрата. Результаты позволили взглянуть на «матричную модель» их формирования по-новому и предположить, что первичным звеном является образование полимерного белкового каркаса.

Цель исследования – изучение механизма патогенеза мочекаменной болезни.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

За последние пять лет феномен «органической матрицы» мы наблюдали десять раз. У всех этих больных, по данным предоперационной компьютерной томографии, определялись крупные (К3-К4) коралловидные камни плотностью до 450 HU. Но вместо них во время операции в полостной системе обнаруживались тягучая слизь и упругая субстанция белого цвета, консистенции «мягкого пластилина», легко расслаивающаяся на части при попытке удаления захватом (рис. 1, 2).

Рис. 1. 3d реконструкция нативной фазы МСКТ: коралловидный камень правой почки плотностью до 450 ед. HU
Fig. 1. 3d reconstruction of the native phase of MSCT: coral-shaped stone of the right kidney with a density of up to 450 HU

Забрать этот материал на анализ в чистом виде, без примеси крови и промывной жидкости, позволила технология лапароскопической пиелолитотомии. Оформленная часть субстанции была помещена в стерильный физиологический раствор при температуре 3ºС и доставлена для изучения в лабораторию Научноисследовательского института химии при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского. Исследование проводили следующим образом. Материал разделили на две части. Первую (образец 1) неоднократно промывали в дистиллированной воде, а затем сушили лиофильно до постоянного веса. Изучение поверхности этого образца проводили на сканирующем электронном микроскопе JSM-IT300 (JEOL Ltd, Japan) с диаметром электронного зонда до 5 нм (рабочее напряжение 20 кВ), с использованием детекторов низкоэнергетичных вторичных электронов и обратно-рассеянных электронов в режиме низкого вакуума для снятия заряда. Элементный анализ осуществляли на элементном анализаторе Vario EL Cube и с помощью рентгеновского микрозондового анализатора (РМА) с детектором X-MaxN 20 (Oxford Instruments, UK). Органическая и минеральная составляющие образца 1 определялись по результатам его сжигания с последующим сопоставлением обнаруженных химических элементов с эталонными значениями для белков, углеводов и сиаловой кислоты.

Рис. 2. Лапароскопическая пиелолитотомия справа: 1 – правая почка; 2 – лоханка почки; 3 – жидкая часть содержимого лоханки; 4 – оформленная часть содержимого лоханки
Fig. 2. Right side laparoscopic pyelolithotomy: 1 – kidney; 2 – renal pelvis; 3 – liquid part of the renal pelvis contents; 4 – solid part of the renal pelvis contents

Второй образец оставили в 3%-ном водном растворе уксусной кислоты при комнатной температуре на сутки – растворилось около 70% (образец 2-1, растворенный за 24 часа). Оставшийся осадок вновь поместили в такой же кислотный раствор при той же температуре, но уже на 3 недели. А затем, этапно фильтруя, держали по 14 дней при 500С и 700С соответственно (образец 2-2 длительного растворения). То, что осталось после растворения, процедили и подвергли анализу. Mолекулярно-массовые характеристики определяли методом гель проникающей хроматографии (ГПХ) с применением высокоэффективного жидкостного хроматографа (Shimadzu CTO20A/20AC) с программным модулем LC-Solutions-GPC. Разделение проводили с применением колонки с диаметром пор 5 мкм (Tosoh Bioscience TSK gel G3000SWxl). В качестве детектора применяли низкотемпературный светорассеивающий детектор ELSD-LT II, элюентом служил 0,5 М раствор уксусной кислоты, скорость потока 0,8 мл/мин, для калибровки использовали узкодисперсные образцы декстрана с диапазоном молекулярных масс (ММ) 1-410 кДа (Fluca).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) установлено, что губка субстанции имеет полимерное строение (рис. 3). При этом отмечены четкие сетчатые очертания каркаса из поперечно связанных коллагеновых фибрилл. Анализ соотношения органической и минеральной составляющих образца 1 верифицировал его природу: это гликопротеин (рис. 4). Результаты исследования молекулярно-массовых характеристик методом ГПХ показали, что 59% образца 2-1, растворившегося за 24 часа, соответствовали ММ 167 кДа, а 35% – 21 кДа. В свою очередь, образец 2-2 длительного растворения имел гораздо более «тяжелые» цепочки: в 87% его молекулярная масса составляла 307 кДа (таб. 1).

Рис. 3. Фотографии СЭМ поверхности образца 1
Fig. 3. SEM images of the sample 1 surface

Рис. 4. Сравнительные данные содержания химических элементов в образце
Fig. 4. Comparative data of the elements content in the sample 1

Таким образом, субстанция, имитировавшая коралловидный камень при МСКТ и извлеченная во время пиелолитотомии, имела фибриллярное строение с сетчатой структурой, являясь, по своей сути, полимером. Данные элементного анализа позволяют отнести составляющие ее высокомолекулярные компоненты к гликопротеинам (по сравнению с белками, за счет полисахаридов, в них содержится немного больше кислорода и водорода). Выявленные значения молекулярной массы подтверждают содержание в субстанции высокомолекулярных соединений (табл. 1).

Таблица 1. Данные ГПХ растворившейся части образца 2
Table 1. GPC data of the dissolved part of the sample 2

ОБСУЖДЕНИЕ

Истинные причины развития МКБ пока не раскрыты, впрочем, независимо от особенностей возникновения, все конкременты содержат органический матрикс. Пусть его доля и составляет лишь 2-3%, но именно он является каркасом для формирования камня. Оставшаяся бóльшая часть (97-98%) приходится на минеральную составляющую, обеспечивающую послойное внешнее солевое покрытие [6]. Исследования, проведенные в этой области, говорят о том, что основой органической части камней являются белки Тамма-Хорсфала (уромодулин), S100A8 и S100A9, альбумин и остеопонтин [7, 8]. Они отвечают за различные функции. Например, S100A8 и S100A9, образующие при соединении друг с другом димер под названием кальпротектин, участвуют в реакции воспаления, регулируют обмен кальция, магния, цинка, других микрои макроэлементов, а также принимают участие в иммунном ответе [9]. Белок Тамма-Хорсфала, или уромодулин, – основной гликопротеин мочи, имеющий множество функций, главной из которых является поглощение кальция в дистальном извитом канальце (снижая при этом риск гиперкальцурии и образования камней в почках). Тем не менее, при определенных условиях он может переходить в патологическую форму и полимеризироваться в длинные цепи, достигая очень больших размеров [10].

В 2021 г. Y. Yang и соавт. опубликовали результаты анализа протеинового состава мочевых камней. Несмотря на то, что авторы исследовали органическую составляющую в «зрелых», уже сформировавшихся конкрементах, а мы смогли изучить саму предтечу, «матрицу» зарождающегося камня, в статье приведен спектр и молекулярные массы обнаруженных белков [8]. Сопоставив по молекулярной массе собственные результаты с данными китайских коллег, мы верифицировали белки, входящие в состав нашего образца (табл. 2).

Как видно из таблицы 2, более половины высокомолекулярных соединений в исследованной нами субстанции относятся к белкам, которые тем или иным образом участвуют в процессе воспаления: миелопероксидаза и иммуноглобулин. Кальпротектин (S100A8\ S100A9) вместе с транспортными белками (ретинолсвязывающим и эозинофильным катионным) совпадает по значению ММ с 35% выявленных макромолекул. Оставшаяся часть (2,3%) полимерных молекул с низкими молекулярными массами может быть отнесена к белкам, выполняющим транспортную функцию. Гидролизаты – это фрагменты деструктировавших белков в результате частичного кислотного гидролиза в присутствии уксусной кислоты. Однако молекулярно-массовые характеристики образца 2-2 после длительного растворения при различных условиях говорят о содержании в субстрате сетчатого высокомолекулярного белка, способного к полимеризации и построению длинных «тяжелых» цепочек. Подобное образование больших гелеподобных частиц (как ядра кристаллизации) вследствие полимеризации характерно для белка Тамма-Хорсфалла [11-13]. Молекулярная масса нашего образца совпала с ММ последнего.

Таблица 2. Процентное соотношение идентифицированных белков в части субстрата [8]
Table 2. The percentage of identified proteins in the dissolved part of the substrate [8]

Конечно, остается много неясного. Например, почему очень неплотное вещество белковой структуры выглядит по данным МСКТ как камень плотностью 400 HU (как губчатое вещество костей)? Ответить на этот и другие вопросы поможет проведение дальнейших исследований и новых экспериментов.

ВЫВОДЫ

Результаты настоящего исследования позволяют предположить, что формирование камней начинается с образования каркаса из полимеризованных белков воспаления, как первичной «матрицы». После чего происходит ее кристаллизация и появление уролита, а за счет минерализации, в зависимости от солевого состава и кислотности мочи, формируется конкремент той или иной плотности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Севрюков Ф.А., Малинина О.Ю., Елина Ю.А. Особенности заболеваемости населения Нижегородской области, Приволжского федерального округа и Российской Федерации болезнями мочеполовой системы и предстательной железы. Социальные аспекты здоровья населения 2011;(6):8. [Sevryukov F.A., Malinina O. Yu., Elina Yu.A. Peculiar features of morbidity of the population with disorders of the genitourinary system and diseases of the prostate gland, in particular, in the Russian Federation, in the Privolzhsky (Volga) federal district, and in the Nizhni Novgorod region. Social'nye aspekty zdorov'ya naseleniya = Social aspects of population health 2011;(6): 8. (In Russian)].
2. Аполихин О.И., Севрюков Ф.А., Сорокин Д.А., Карпухин И.В., Пучкин А.Б., Семенычев Д.В. и соавт. Состояние и прогнозы заболеваемости взрослого населения Нижегородской области. Экспериментальная и клиническая урология 2012;(4):4-6. [Apolihin O.I., Sevryukov F.A., Sorokin D.A., Karpuhin I.V., Puchkin A.B., Semyonychev D.V. et al. The state and forecasts of morbidity in the adult population of the Nizhny Novgorod region. Eksperimental'naya i klinicheskaya urologiya = Experimental and clinical urology 2012;(4):4-6. (In Russian)].
3. Sorokin I, Mamoulakis C, Miyazawa K, Rodgers A, Talati J, Lotan Y. Epidemiology of stone disease across the world. World J Urol 2017;35(9):1301-20. https://doi.org/10.1007/s00345-017-2008-6.
4. Аполихин О.И., Сивков А.В., Комарова В.А., Просянников М.Ю., Голованов С.А., Казаченко А.В. и соавт. Заболеваемость мочекаменной болезнью в Российской Федерации (2005-2016 годы). Экспериментальная и клиническая урология 2018;(4):4-14. [Apolihin O.I., Sivkov A.V., Komarova V.A., Prosyannikov M.Yu., Golovanov S.A., Kazachenko A.V. et al. Incidence of urolithiasis in the Russian Federation (2005-2016). Eksperimental'naya i klinicheskaya urologiya = Experimental and clinical urology 2018;(4):4-14. (In Russian)].
5. Бакетин П.С., Моллаев Р.А., Мазуренко Д.А., Григорьев В.Е., Гаджиев Н.К., Обидняк В.М., и соавт. Патогенетические варианты мочекаменной болезни. Педиатр 2017;8(1):95-105. [Baketin P.S., Mollaev R.A., Mazurenko D.A., Grigor'ev V.E., Gadzhiev N.K., Obidnyak V.M., et al. Pathogenetic variants of urolithiasis. Pediatr = Pediatr 2017;8(1):95-105. (In Russian)].
6. Steenbeke M, De Buyzere ML, Speeckaert MM, Delanghe JR. On the protein content of kidney stones: an explorative study. Acta Clin Belg 2021;(6):1-8. https://doi.org/10.1080/17843286.2021.1999569.
7. Каткова В. И. Матричная минерализация уролитов. Вестник Института геологии Коми НЦ УрО РАН 2011;(8):15-7. [Katkova V.I. Matrix mineralization of uroliths. Vestnik Instituta geologii Komi NC UrO RAN = Bulletin of the Institute of Geology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences 2011;(8):15-7. (In Russian)].
8. Yang Y, Hong S, Li C, Zhang J, Hu H, Chen X, et al. Proteomic analysis reveals some common proteins in the kidney stone matrix. Peer J 2021;9:e11872. https://doi.org/10.7717/peerj.11872.
9. Brophy MB, Nolan EM. Manganese and microbial pathogenesis: sequestration by the Mammalian immune system and utilization by microorganisms. ACS Chem Biol 2015;10(3):641-51. https://doi.org/10.1021/cb500792b.
10. Wolf MTF, Zhang J, Nie M. Uromodulin in mineral metabolism. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28(5):481-9. https://doi.org/10.1097/MNH.0000000000000522.
11. Hess B, Jordi S, Zipperle L, Ettinger E, Giovanoli R. Citrate determines calcium oxalate crystallization kinetics and crystal morphology-studies in the presence of Tamm-Horsfall protein of a healthy subject and a severely recurrent calcium stone former. Nephrol Dial Transplant 2000;15(3):366-74. https://doi.org/10.1093/ndt/15.3.366.
12. Robertson WG, Scurr DS. Modifiers of calcium oxalate crystallization found in urine. I. Studies with a continuous crystallizer using an artificial urine. J Urol 1986;135(6):1322-6. https://doi.org/10.1016/s0022-5347(17)46084-8.
13. Ланда С.Б., Аль-Шукри С.Х., Горбачев М.И., Егоров В.В., Эмануэль Ю.В., Эмануэль В.Л. Патохимические особенности олигомерных форм белка Тамма-Хорсфалла при уролитиазе. Клиническая лабораторная диагностика 2016;61(6):335-41. [Landa S.B., Al-Shukri S.H., Gorbachev M.I., Egorov V.V., Emanuel Yu.V., Emanuel V.L. Pathochemical features of oligomeric forms of Tamm-Horsfall protein in urolithiasis. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika = Russian Clinical Laboratory Diagnostics 2016;61(6):335-41. (In Russian)].