В последние годы спектр клещевых инфекций существенно расширился. Если ранее ученые полагали, что анаплазмоз, вызванныйAnaplasma phagocytophilum, характерен в основном только для домашних животных, то в настоящее время диагноз анаплазмоза очень часто ставят человеку, пострадавшему от укуса клеща. Гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) относится к острым лихорадочным заболеваниям с трансмиссивным путем передачи, переносчиками которого являются иксодовые клещи. Возбудителем заболевания является Anaplasma phagocytophillum, относящаяся к роду Anaplasma, семейства Anaplasmataceae. По данным, представленным Е.Н. Ильинских с соавт., первый случай ГАЧ зарегистрирован в Томской области в 2006 году и, начиная с 2013 года, в области отмечен резкий подъем заболеваний, вызванных анаплазмами, при этом среди невирусных клещевых инфекций, поражающих человека в 72,1% случаев, наблюдается ГАЧ, а в 27,9% – моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ) [1].

При анализе 228 сывороток крови у обратившихся по поводу укуса клеща в серопрофилактические пункты г. Тюмени в 34,2% случаях были обнаружены анаплазмы (ГАЧ) и в 28,9% эрлихии (МЭЧ) [2]. Исследование, проведенное С.И. Логвиновым на крупном рогатом скоте, свидетельствует о способности некоторых видов анаплазм индуцировать в клетках крови микроядра, возникающие в результате отставания в анафазе митоза фрагментов или целых хромосом [3]. Показано также влияние анаплазм на репродуктивные функции животных, сопровождаемые изменениями структуры семенников и патологией морфологии сперматозоидов [4-5]. Исследований, свидетельствующих о способности анаплазм индуцировать цитогенетические и кариопатологические аберрации в соматических клетках и патологические изменения сперматозоидов у человека, в доступной литературе авторы не обнаружили.

Настоящая работа посвящена исследованию тератозооспермии и кариопатологических изменений клеток крови у больных и переболевших анаплазмозом, а также у лиц с хроническим бессимптомным носительством анаплазм.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследованы 16 лиц мужского пола больных анаплазмозом, находящихся на лечении в инфекционных отделениях больниц в г. Тюмени и г. Томске. Материалом для кариопатологического анализа послужила кровь из локтевой вены и семенная жидкость пациентов. Больных обследовали во время госпитализации (1-2 день начала заболевания), через 1 и 3 месяца после выписки из стационара. Кроме того аналогичный анализ однократно проведен у 18 мужчин, у которых методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) при плановом обследовании работников различных учреждений выявлено бессимптомное носительство анаплазм. Возраст обследованных составил, в среднем, 32,5±4,5 лет. Все пациенты в течение одного года не подвергались лучевым процедурам и до начала заболевания не получали лекарственную терапию. Большинство из обследованных предъявляли жалобы на отсутствие либидо, резкую утрату полового влечения, что стало одной из причин для изучения у них патологических изменений сперматозоидов в семенной жидкости. В группу контроля были включены 14 здоровых доноров станции переливания крови аналогичной возрастной группы. Предварительно у каждого обследованного было взято информированное согласие на проведение настоящего исследования, которое соответствовало требованиям Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2013 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава России от 19.06.2003 п. № 266.

Диагноз заболевания устанавливали на основании клинической картины и эпидемиологических данных, темнопольной микроскопии мазков крови с выявлением интрацитоплазматических морул анаплазм в инфицированных нейтрофилах, а также положительных результатов серологических тестов (иммуноферментный анализ). Для выявления антител к ГАЧ (Ig М и Ig G) использовались диагностические тест-системы фирмы «Омникс» (Санкт-Петербург). Для подтверждения диагноза у всех обследованных с помощью ПЦР определялось наличие праймеров на участок ДНК 16S субъединицы рРНК возбудителя с помощью набора для выделения геномной ДНК из бактерий компании «Синтол» (Москва). Синтез олигонуклеотидов производился на автоматическом ДНК/РНК синтезаторе ASM1000 ("Биоссет", Новосибирск). Очистка проводилась в полиакриламидном геле. Амплификацию выполняли на приборе типа «Терцик-МС2» (Москва) с применением термостабильной Taq-полимеразы ("СибЭнзим", Новосибирск) согласно рекомендациям фирмыпроизводителя полимеразы. Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Документирование результатов осуществляли на видиосистеме «Vitran» (Биоком).

У всех обследованных пациентов проведены кариопатологические исследования, выявившие следующее: изменения интерфазных ядер в моноцитах крови с регистрацией числа клеток бинуклеаров, с микроядрами и протрузиями, хроматинолизом, фрагментолизом, кариорексисом, кариопикнозом, кариолизисом и вакуолизацией ядра; гиперсегментированность, хроматинолиз и фрагментолиз ядра нейтрофилов крови; наличие микроядер в эритроцитах крови; присутствие патологических изменений размера, формы, акросомальной области сперматозоидов, дефекты числа головок, шейки, хвостовой области в мазках семенной жидкости. Для морфологически нормального сперматозоида характерна овальная форма головки, длина которой составляет 5-6 мкм, ширина 2,5-3,5 мкм, акросомальный участок занимает от 40 до 70% площади головки, при этом отсутствуют аномалии шейки, хвоста и срединного отдела. У исследуемых пациентов фиксировались выраженные изменения размеров головки сперматозоида, что подтверждалось путем измерения окуляр-микрометром.

Изменения формы, дефекты акросомальной области, удвоение головки сперматозода, а также аномалии шейки и хвоста оценивались визуально согласно методических указаний ВОЗ и строгих критериев Крюгера [6,7]. Микроскопически был проведен анализ не менее 10 000 моноцитов, нейтрофилов, эритроцитов крови и сперматозоидов. Методические особенности приготовления препаратов и их анализ изложены нами ранее [8]. Кроме того семенная жидкость изучена также на предмет лейкоцитоспермии. Особое внимание при этом обращали на присутствие в сперме инфицированных нейтрофилов.

Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ STATISTICA v.10.0 и BIOSTAT (Primer of Biostatistic version 4.03). Все количественные показатели обрабатывали с применением корреляционного анализа по Спирмену и t-критерия Стьюдента для независимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова не выявило отличий от нормального. Анализ статистических различий качественных признаков производили с использованием теста χ2 с поправкой Йейтса на непрерывность [9]. Различия сравниваемых результатов (X±m, где X – выборочное среднее арифметическое, m – ошибка среднего арифметического) считались достоверными при достигнутом уровне значимости p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что в первые дни заболевания анаплазмозом наблюдается значимо повышенный уровень по сравнению с группой контроля практически всех регистрируемых показателей патологий клеток крови и сперматозоидов (табл. 1).

Таблица 1. Частота выявления клеток крови с патологическими изменениями и показатели тератозооспермии у людей, инфицированных анаплазмами, и здоровых доноров

Примечание. Значимые различия показателей у обследованных пациентов по сравнению с группой контроля отмечены звездочками: одной – при р<0,05; двумя – при p<0,01; тремя – при p<0,001.

Наличие вакуолизации в ядре моноцитов крови указывает на глубокие изменения в клетке и тяжелую степень патологического процесса. Вакуолизация часто сочетается с другими структурными изменениями клетки. Ранняя деструкция ядра моноцита цитологически начинается с образования перинуклеарной вакуоли [10]. В группе контроля число моноцитов с перинуклеарной вакуолью составило 0,71±0,33‰, у пациентов основной группы на 1-2 день заболевания – 5,18±0,73‰(p<0,01), на 30 день – 4,31±0,53‰ (p<0,01). Апоптотический процесс распада хроматина ядра моноцита может выглядеть как хроматинолиз моноцита, при этом хроматин теряет свою нормальную структуру и растворяется. Ядро окрашивается в светлый цвет, контуры его сохраняются. В группе контроля указанный тип кариопатологических изменений составил 1,82±0,53‰, у пациентов основной группы в начале заболевания – 6,12±0,53‰ (p<0,01), через месяц после начала заболевания – 4,42±0,51(p<0,05). Фрагментоз моноцитов представляет собой процесс, при котором от ядра отделяются отдельные фрагменты, часто связанные с ядром тонкими нитями базихроматина. Частота выявления подобных моноцитов с фрагментозом в первые дни госпитализации пациентов основной группы составила 5,02±0,73‰ при значении 0,73±0,20‰ в группе контроля (p<0,001). Повышенный уровень фрагментоза моноцитов сохранялся у пациентов основной группы и через месяц наблюдения (p<0,05). Кариолизис, представляющий собой растворение части ядра, контуры которого становятся нечеткими, размытыми, составил 0,23± 0,12‰ в группе контроля и 2,56± 0,54‰ у пациентов на 1-2 день болезни (p<0,001). Частота выяления моноцитов с кариорексисом или распадом ядра на отдельные не связанные друг с другом части, зачастую являющимся заключительным этапом гибели клетки и образующийся при формировании многогруппового аномального митоза [10], составила в группе контроле 0,12±0,10‰; в основной группе – на 1-2 день наблюдения 2,62±0,61% (p<0,001), на 30 день – 1,33±0,21 (p<0,001).

У пациентов основной группы в период госпитализации и через 1-3 месяца после выписки из стационара, а также при бессимптомном носительстве анаплазм отмечено снижение числа моноцитов крови с кариопикнозом по сравнению с группой контроля, что может свидетельствовать о процессах деконденсации хроматина в указанных клетках [11]. Обследование пациентов основной группы через 3 месяца после выписки из стационара показало нормализацию большинства анализируемых показателей за исключением частоты встречаемости моноцитов с микроядрами и протрузиями. При бессмптомном носительстве анаплазм значимо, по сравнению с группой контроля, возрастало число моноцитов с микроядрами и протрузиями (p<0,01), другие показатели кариопатологических изменений моноцитов были в пределах контрольных значений.

Анализ микроядер и протрузии позволяет сделать вывод о том, что анаплазмы способны вызывать поражения хромосомного аппарата клеток крови. Причем значимое повышение такого рода нарушений наблюдается не только в ядросодержащих клетках крови – моноцитах, но и в эритроцитах. Совершенно очевидно, что в этом случае изменения должны возникать на ранних этапах эритропоэза в эритробластах. Поскольку большинство наблюдаемых микроядер в моноцитах и эритроцитах у основной группы больных имеют небольшие размеры (менее 3 микрон), то логично предположить о том, что этот инфекционный агент опосредовано индуцирует аберрации хромосом и образовавшиеся ацентрические фрагменты формируют микроядра. Имеется мнение, что в основе патогенного действия Anaplasma phagocytophilum лежит повышение активности катепсина L в нейтрофилах крови, который способствует возникновению одноцепочечных разрывов ДНК и образованию микроядер [12,13]. К другому типу цитогенетических нарушений, возникающем при инфицировании микоплазмами, следует отнести существенное возрастание числа двуядерных моноцитов. Анализ этих клеток показал идентичность размеров, структуры хроматина и интенсивности окраски между ядрами в бинуклеаре и это может свидетельствовать в пользу вывода о том, что такие клетки формируются в результате блокады цитокинеза.

Анализ морфологических изменений сперматозоидов в период начала госпитализации показал наличие значительного увеличения в семенной жидкости больных числа сперматозоидов с дефектами головки. Также по сравнению с группой контроля, отмечен рост числа сперматозоидов с изменением размеров и формы головки, с аномалиями акросомальной области, двойной головкой, дефектами шейки, при этом число сперматозоидов с дефектами в области хвоста не отмечено. У бессимптомных носителей анаплазм значимого возрастания числа аномальных сперматозоидов по сравнению с группой контроля не наблюдалось.

В своих исследованиях B.L Swi и соавт. впервые описали патологический процесс, протекающий в половых органах самцов овец, зараженных анаплазмами, относящихся к виду Anaplasma marginale [14]. Проводя исследования на животных, искусственно зараженных анаплазмами, авторы установили снижение у них полового возбуждения при спаривании и ухудшение качества спермы. Изучая морфологию спермиев, они отметили основную патологию – отделение головки, причем количество патологических клеток спермы изменялось прямо пропорционально степени тяжести болезни. После проведения гистологических исследований тканей семенников авторы обнаружили дистрофические изменения разной степени тяжести: недостаток зрелых спермиев, дегенерация сперматид, некротизация сперматид и мультинуклеарный фагоцитоз гигантских клеток, процесса дегенерации: кариопикноз, вакуолизация клеток семенных канальцев. У новорожденных самцов, рожденных от животных, пораженных анаплазмами, развивается пролиферативный интерстицеальный орхит с частичным сохранением сперматогенного эпителия.

Как известно, анаплазмоз сопровождается существенными изменениями гуморального и клеточного иммунитета [15]. При противоинфекционном иммунитете значительную роль в устранении цитогенетически измененных клеток играет Т-звено иммунитета и естественные клетки-киллеры [16]. Поражение указанного звена иммунитета сопровождается существенным увеличением числа цитогенетически измененных клеток, поскольку в организме больного ослабевает иммунная система, призванная поддерживать цитогенетический гомеостаз организма. Известно, что анаплазмы в виде морул локализуются в нейтрофилах крови. Наши исследования показали наличие в крови больных значимо повышенного числа нейтрофилов с гиперсегментированным ядром и прогрессирующий процесс хроматинолиза и фрагментоза ядра клетки. Особенно существенные изменения наблюдались в нейтрофилах при локализации в цитоплазме клетки морул бактерий. Нахождение таких нейтрофилов в сперме позволяет предположить, что высокая гиперферментия этих клеток может вызвать некоторые морфологические изменения сперматозоидов. Кроме того, размножение анаплазм в нейтрофилах приводит к ослаблению иммунных защитных реакций организма, поэтому зачастую анаплазмоз сопровождается оппортунистическими бактериальными, вирусными или грибковыми инфекциями [17]. Поэтому не исключено, что наблюдаемые нами эффекты могут является сочетанным действием разнообразных микст инфекций.

Анализ морфологических изменений сперматозоидов свидетельствует о том, что у больных анаплазмозом наблюдается значительное увеличение в семенной жидкости числа сперматозоидов с дефектами головки. Также по сравнению с группой контроля отмечен рост числа сперматозоидов с изменением размеров и формы головки, с аномалиями акросомальной области, двойной головкой, дефектами шейки. При этом сперматозоидов с дефектами в области хвоста выявлено не было. Особенно значительные изменения морфологии сперматозоидов наблюдались при присутствии в сперме нейтрофилов, несущих морулы бактерий. По мнению S.H. Sinclair и соавт. [18] на сегодняшний день единственными прокариотическими нуклеомодулинами, которые непосредственно связываются с ДНК млекопитающих и влияют на окружающий хроматин клеток хозяина, являются нуклеомодулины бактерии семейства Anaplasmataceae, к которому относится Anaplasma phagocytophilum. Авторы предположили, что нуклеомодулины могут действовать широко, влияя на целые геномы соседних неинфицированных клеток, путем ремоделирования хроматина, изменяя его структурную организацию. Вполне возможно, что именно с этим процессом связаны наблюдаемые нами кариопатологические процессы в клетках крови и изменения морфологии сперматозоидов семенной жидкости, поскольку в настоящем исследовании у пациентов с анаплазмозом выявлено наличие инфицированных нейтрофилов в эякуляте. По мнению P. Thonneau и соавт. значительный уровень цитогенетических аномалий в соматических клетках является одним из маркеров бесплодности мужчин [19].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цитологический анализ клеток крови (моноциты, нейтрофилы, эритроциты) и сперматозоидов эякулята у пациентов с ГАЧ свидетельствует о значимых кариопатологических изменениях в данных клетках. Наличие среди измененных клеток крови клеток с микроядрами позволяет сделать заключение о существовании при ГАЧ повышенного уровня цитогенетических повреждений хромосомного аппарата анализируемых клеток. Возрастание числа цитогенетических нарушений в виде микроядер зарегистрированы и у бессимптомных носителей анаплазм. Одновременно, при инфицировании анаплазмами у пациентов отмечено возрастание показателей тератозооспермии в виде патологических изменений головки и шейки сперматозоидов как при ГАЧ, так и у бессимптомных носителей анаплазм.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ильинских Е.Н., Лукашова Л.В., Лепехин А.В., Замятина Е.В., Портнягина Е.В., Полторацкая Т.Н., и др. Клинико-эпидемиологические аспекты микст- и моно-инфекций, вызванных эрлихиозами. Известия Самарского научного центра РАН 2015; 17(5): 377-380.
2. Брагина Е.А. Риск заражения людей моноцитарным эрлихиозом и гранулоцитарным анаплазмозом в различных ландшафтных подзонах Тюменской области. Вестник Тюменского государственного университета 2010; 3: 111-116.
3. Логинов С.И. Микроядерный анализ эритроцитов при различных функциональных состояниях организма крупного рогатого скота. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки 2003; 3: 73-76.
4. McEnteeм M. Reproductive Pathology of Domestic Mammals. Elsevier Science 2012; 2: 408 p.
5. Теплова Е.И., Чвалун В.А., Кошкина Н.А., Мишенина Е.В. Хроническое течение анаплазмоза у племенных баранов при экспериментальном заражении. Труды СНИИЖиК 2004; 2(2): 128-136.
6. World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction. 3rd edition. Cambridge: Cambridge University Press; 1992. 124 p.
7. Check JH, Adelson HG, Schubert BR, Bollendorf A. Evaluation of sperm morphology using Kruger’s strict criteria. Arch Androl 1992; 28(1): 15-17.
8. Ильинских Н.Н., Ксенц А.С., Ильинских Е.Н., Манских В.Н., Васильев С.А., Ильинских И.Н. Микроядерный анализ в оценке цитогенетической нестабильности. Томск: изд-во ТГПУ; 2011; 234 с.
9. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. М.: «Филинъ»; 1997; 608 с.
10. Ильинских Н.Н., Васильев С.А., Кравцов В Н. Микроядерный тест в скрининге и мониторинге мутагенов. Saarbrucken (Deutschland): LAP LAMBERT Academic Publishing GmbH&Co.KG; 2011; 216 с.
11. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию. М.: Академкнига. 2004; 284 с
12. Thomas V, Samanta S, Fikrig E. Anaplasma phagocytophilum Increases Cathepsin L Activity, thereby Globally Influencing Neutrophil Function. Infection and Immunity 2008; 76(11): 4905-4912. http://doi:10.1128/IAI.00851-08
13. Goyal S. Involvement of Cathepsin in Mitochondrial Apoptosis by P-Phenylenediamine Under Ambient UV Radiation. J Hazard Mater 2015;300: 415-425. http://doi:10.1016/j.jhazmat.2015.07.032
14. Swift BL, Reeves JD, Thomas GM. Testicular degeneration and libido loss in beef bulls experimentally inoculated with anaplasma marginale. Theriogenology 1979; 11(4):277-290.
15. Афанасьева М.В. Гранулоцитарный анаплазмоз человека: особенности клинических проявлений в России. Инфекционные болезни 2006; 4(2): 24-28.
16. Ильинских Н.Н., Ильинских И.Н. Бочаров Е.Ф. Цитогенетический гомеостаз и иммунитет. Новосибирск: Наука; 1986; 256 с.
17. Bakken JS, Dumler JS. Human Granulocytic Anaplasmosis. Infect Dis Clin North Am 2015; 29(2): 341–355. http://doi:10.1016/j.idc.2015.02.007
18. Sinclair SH, Rennoll-Bankert KE, Dumler JS. Effector bottleneck: microbial reprogramming of parasitized host cell transcription by epigenetic remodeling of chromatin structure. Front Genet 2014; 14: 126-132.http://doi: 10.3389/fgene.2014.00274
19. Thonneau P, Marchand S, Tallec A, Ferial ML, Ducot B, Lansac J. et al. Incidence and main causes of infertility in a resident population (1, 850, 000) of three French regions. Hum Reprod 1991; 6: 811–816.