ВВЕДЕНИЕ
Стандартное спермиологическое исследование, выполняемое согласно руководству ВОЗ, остается на сегодняшний день основным методом оценки мужской фертильности [1]. Вместе с тем, данный метод исследования имеет ряд существенных ограничений, в том числе низкую прогностическую ценность в отношении результатов программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и исходов беременности, достигнутой естественным путем [2].
Ограничения стандартного спермиологического исследования диктуют необходимость использования дополнительных методов оценки мужской фертильности. В качестве наиболее перспективного и широко используемого теста выступает оценка уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. Результаты недавних исследований демонстрируют связь уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с нарушением развития эмбрионов в программах ВРТ, вероятностью наступления беременности в программах ВРТ и при естественном зачатии, а также с невынашиванием беременности [2-8].
Вопрос широкого внедрения исследования фрагментации ДНК сперматозоидов в клиническую практику и определение показаний к данному исследованию по-прежнему обсуждается. Важным фактором, ограничивающим его использование, является отсутствие стандартизации существующих методов оценки фрагментации ДНК [9]. Дополнительным фактором, ограничивающим широкое внедрение исследования фрагментации ДНК сперматозоидов (ФДС) в диагностику мужского бесплодия, является стоимость. По сравнению с другими тестами на фертильность мужчин, тест на фрагментацию ДНК является дорогостоящим, при этом расходы, как правило, ложатся на пациента. В связи с этим активно изучается корреляция между уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов и стандартными параметрами спермы, что потенциально может позволить отбирать пациентов, которым выполнять исследование фрагментации ДНК сперматозоидов нецелесообразно.
Целью настоящего исследования явилось изучение связи уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с показателями стандартного спермиологического исследования и возрастом мужчин.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования послужили результаты обследования 121 мужчины в возрасте от 21 года до 53 лет (средний возраст 32,7±4,5 года), прошедших обследование в клинике «Мать и Дитя Ярославль» в период с января 2019 по апрель 2020 года. Исследование носило ретроспективный характер, в связи с чем, фертильный статус мужчин не уточнялся. Критериями исключения для настоящего исследования были тяжелые формы олигозооспермии (концентрация сперматозоидов менее 1 млн/мл) и азооспермия.
Спермиологическое исследование
Образцы спермы были собраны в специально отведенном для этого помещении нашей лаборатории с помощью аудиовизуальной стимуляции после 2-5 дней сексуального воздержания. Стандартное спермиологическое исследование выполнялось согласно последнему изданию Руководства ВОЗ [1].
Исследование уровня фрагментации ДНК сперматозоидов
Повреждение ДНК сперматозоидов оценивали с помощью анализа TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) на основе проточной цитометрии и сообщали % фрагментации ДНК сперматозоидов, отражая процент сперматозоидов с поврежденной ДНК.
Статистическая обработка
Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS 11.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). С целью выявления взаимосвязи уровня фрагментации ДНК сперматозоидов и стандартных параметров спермы, а также возраста мужчин, был применен метод корреляционного анализа с расчетом коэффициента параметрической корреляции Пирсона. Критерием статистической значимости корреляции считали p<0,05. Для интерпретации зависимости силы между параметрами исследования предполагались следующие уровни корреляции: <0,2 – отсутствие связи, 0,2– 0,4 – слабая связь, 0,4–0,7 – умеренная связь, > 0,7- сильная связь. Критерий Манна-Уитни использовали для оценки значимости различий непараметрических непрерывных переменных, таких как параметры спермы. Результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследование уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у 121 мужчины продемонстрировало значения в интервале от 1% до 45,7%, средний показатель 11,4± 7,8%. У 30 пациентов уровень фрагментации ДНК был более 15% (среднее значение 22,0±7,2%), а у 91 пациента уровень фрагментации ДНК был менее 15% (среднее значение 7,9±3,9%). В таблице 1 представлены средние значения параметров стандартного спермиологического исследования в общей выборке и в подгруппах с уровнем ФДС <15% и ФДС ≥15%.
Таблица 1. Результаты стандартного спермиологического исследования
Table 1. Results of a standard sperm examination
Параметр Parameter |
Общее среднее значение ± SD General mean ± SD |
ФДС <15%(n =91) FDS <15%(n = 91) |
ФДС>15% (n = 30) FDS >15% (n = 30) |
Р |
---|---|---|---|---|
Возраст, лет Age, year | 34,3±5,54 | 34,5±5,7 | 33,7±4,8 | 0,45 |
Объем эякулята, мл Volume, ml | 3,82±2,00 | 3,9±2,11 | 3,5±1,6 | 0,44 |
Концентрация, млн/мл Concentration, mln/ml | 46,00±29,5 | 48,5±29,7 | 38,2±27,9 | 0,10 |
Прогрессивная подвижность, % Progressive mobility, % | 52,8±18,8 | 55,07±18,1 | 46,2±19,8 | 0,03 |
Общая подвижность, % Total mobility, % | 60,9±16,5 | 62,8±16,0 | 55,06±16,9 | 0,02 |
Нормальная морфология, % Normal morphology, % | 2,0±1,3 | 2,1±1,2 | 1,8±1,3 | 0,30 |
Доля аномалий головки, % Proportion of head anomalies, % | 68,4±9,1 | 69,2±8,8 | 65,9±9,6 | 0,08 |
Лейкоциты, млн/мл Leukocytes, mln/ml | 0,125±0,05 | 0,18±0,15 | 0,22±0,23 | 0,22 |
Сравнительный анализ групп пациентов с ФДС <15% (n =91) и ФДС ≥15% (n = 30) не выявил достоверных различий по таким параметрам как возраст пациента, объем эякулята, концентрация сперматозоидов, общая подвижность, доля морфологически нормальных форм, процент аномалий головки в структуре морфологических дефектов и концентрация лейкоцитов спермы. Достоверные отличия между группами наблюдались только по параметру прогрессивной подвижности и общей подвижности. Среднее значение доли прогрессивно подвижных форм сперматозоидов было значимо выше в группе пациентов ФДС <15% (55,07±18,1%) по сравнению с группой пациентов с ФДС ≥15% (46,2±19,8%).
Результаты корреляционного анализа (табл. 2) выявили слабую отрицательную связь между уровнем ФДС и долей прогрессивно-подвижных форм – r = -0,26 (p<0,01). Корреляция ФДС с другими параметрами спермы (объем, концентрация, общая подвижность, нормальная морфология, дефекты головки, концентрация лейкоцитов) и возрастом пациентов признана очень слабой и статистически незначимой.
Таблица 2.Корреляции Пирсона уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с возрастом и параметрами стандартного спермиологического исследования
Table 2. Pearson correlations of the level of sperm DNA fragmentation with age and parameters of standard sperm examination
Параметр Parameter |
Коэффициент корреляции Correlation coefficient |
Р |
---|---|---|
Возраст, лет Age, year | -0,021 | 0,820 |
Объем эякулята, мл Volume, ml | 0,010 | 0,915 |
Концентрация Concentration | -0,171 | 0,061 |
Количество Number | -0,140 | 0,126 |
Прогрессивно-подвижных Progressively mobile | -0,262 | 0,004 |
Общая подвижность General mobility | -0,053 | 0,591 |
Непрогрессивно-подвижных Non-progressive-mobile | 0,178 | 0,050 |
Неподвижных Non-progressive-mobile | 0,130 | 0,156 |
Морфология Morphology | -0,157 | 0,086 |
Дефекты головки Head defects | -0,053 | 0,560 |
Лейкоциты Leukocytes | -0,192 | 0,013 |
Дополнительно выполнено парное сравнение частоты встречаемости повышенной ФДС (>15%) в группах нормальный объем спермы/олигоспермия, нормальная концентрация сперматозоидов/олигозооспермия, нормальная морфология/тератозооспермия, нормальная прогрессивная подвижность сперматозоидов /астенозооспермия (табл. 3).
Таблица 3. Частота встречаемости нормальной и повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов в подгруппах нормальное значение параметров спермы/отклонение от нормы
Table 3. Frequency of occurrence of normal and increased sperm DNA fragmentation in subgroups of normal sperm parameter / deviation from the norm
Параметр Parameter |
Фрагментация ДНК сперматозоидов Sperm DNA fragmentation |
Асимптотическая значимость (2-сторонняя) Asymptotic significance (2-sided) |
||
---|---|---|---|---|
ФДС <15% FDS <15% | ФДС>15% FDS >15% | |||
Объем эякулята Volume |
Нормальный объем, % (n) Normal volume, % (n) |
95,7% (89) | 100,0% (28) | 0,641 |
Олигоспермия, % (n) Oligospermia, % (n) |
4,3% (4) | 0,0% (0) | ||
Концентрация Concentration |
Нормальная концентрация, % (n) Normal concentration, % (n) |
87,1% (81) | 82,1% (23) | 0,157 |
Олигоспермия, % (n) Oligospermia, % (n) |
12,9% (12) | 17,9% (5) | ||
Прогрессивная подвижность Progressive mobility |
Нормальная прогрессивная подвижность, % (n) Normal progressive mobility, % (n) |
88,2% (82) | 78,6% (22) | 0,036 |
Астенозооспермия, % (n) Asthenozoospermia, % (n) |
11,8% (11) | 21,4% (6) | ||
Морфология Morphology |
Нормальная морфология, % (n) Normal morphology, % (n) |
13,2% (12) | 10,0% (3) | 0,296 |
Тератозооспермия, % (n) Teratozoospermia, % (n) |
86,8% (79) | 90,0% (27) |
Результаты анализа продемонстрировали, что повышенная ФДС в 1,8 раз чаще встречается среди пациентов с астенозооспермией (21,4%) по сравнению с пациентами с нормальной подвижностью сперматозоидов (11,8%) (p <0,05). Сравнительный анализ в группах нормальная морфология сперматозоидов/тератозооспермия и нормальное количество сперматозоидов/олигозооспермия, нормальный объем спермы/олигоспермия не выявил достоверных различий.
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты проведенного нами ретроспективного исследования продемонстрировали связь между прогрессивной подвижностью и уровнем ФДС при отсутствии взаимосвязи между уровнем ФДС и возрастом, а также другими параметрами спермы (морфология, общее количество сперматозоидов). Выявленная корреляция между долей прогрессивно-подвижных форм и уровнем ФДС характеризуется как слабая (r = -0,26), при этом повышенный уровень ФДС (≥15%) в 1,8 раза чаще встречается среди пациентов с астенозооспермией по сравнению с пациентами с нормальной подвижностью сперматозоидов.
Причина взаимосвязи уровня ФДС и прогрессивной подвижности сперматозоидов не совсем ясна. Вероятно, это связано с тем, что упаковка хроматина (замена гистонов на протамины в ядре сперматозоида) и развитие жгутика сперматозоида происходят на одном и том же этапе сперматогенеза – спермиогенезе [10]. Экспериментальные исследования на животных моделях, в которых процесс упаковки хроматина искусственно нарушался за счет снижения экспрессии протамина или переходных белков, продемонстрировали связь нарушенной упаковки хроматина с уровнем аномалий жгутика и низкой подвижностью сперматозоидов [11, 12]. Так же предполагается роль оксидативного стресса, так как избыток активных форм кислорода может приводить к перекисному окислению липидов мембраны сперматозоидов и нарушению подвижности, а транслокация перекисей липидов в ядро может привести к повреждению ДНК сперматозоида [13, 14].
На сегодняшний день, связь между уровнем ФДС и параметрами стандартного спермиологического исследования остается противоречивой. В таблице 4 представлены результаты исследований, изучающих связь ФДС с результатами стандартного спермиологического исследования.
Таблица 4. Результаты исследований, изучавших связь фрагментации ДНК сперматозоидов с результатами стандартного спермиологического исследования
Table 4. Results of studies investigating the relationship of sperm DNA fragmentation with the results of standard sperm examination
Метод оценки ФДС FDS estimation method |
Подгруппы Subgroups |
Дни воздержания Days of abstinence |
Объем Volume |
Концентрация Concentration |
Прогрессивно- подвижные формы Progressively mobile forms |
Общая подвижность General mobility |
Жизнеспособность Viability |
Морфология Morphology |
Аномалии головки Anomalies of the head penis |
||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Keshteli S.H., 16 [10] | 7 | SCD | -0,05 NS | -0,15 NS | -0,60** | ||||||
Belloc. S., 2014 [17] | 13 | TUNEL | астенозооспермия | -0,002 NS | 0,18** | -0,13NS | |||||
53 | олигозооспермия | 0,14 NS | -0,08 NS | -0,1 NS | |||||||
18 | тератозооспермия | -0,13 NS | -0,26** | -0,12NS | |||||||
Evgeni E., 2015 [18] | 69 | CD | пормоспермия | 0,374NS | -0,036 NS | -0,175 NS | -0,211 NS | ||||
патоспермия | -0,017 NS | -0,189 NS | -0,536** | -0,180 NS | |||||||
Le M.T., 2019 [22] | 18 | CD | -0,022 NS | -0,080 NS | -0,168 * | -0,85 NS | 0,55*a | 0,202** | |||
Brahem S.,2012 [23] | 0 | UNEL | 0,646** | 0,878**o | 0,434a | ||||||
Samplaski M.K., 2015[31] | 049 | CD | -0,83** | ||||||||
Al Omrani B., 2018 [19] | 4 | CD | ФДС <15% | -0,06 NS | -0,02 NS | -0,36* | -0,096 NS | ||||
ФДС 15-30% | 00,209 NS | -0,133 NS | -0,334 NS | -0,018 NS | |||||||
ФДС> 30% | 00,18 NS | -0,009 NS | -0,334 NS | 0,198 NS | |||||||
Gill K., 2019 [15] | 67 | CD | -0,010 NS | -0,289** | -0,524** | -0,524** | -0,457** | ||||
Stahl P.J., 2015 [16] | 12 | CSA | -0,06 NS | -0,34** | -0,45** | -0,1 NS | |||||
UNEL | -0,1NS | -0,01NS | -0,15* | 0,06 NS | |||||||
Yuan M., 2019 [20] | 39 | CSA | 0,332* | 0,157NS | -0,266* | -0,194* | -0,248* | -0,191* | |||
Homa S.T., 2019 [21] | 96 | CSA | -0,486** | 0,539** | -0,572** | -0,19* |
Примечание. Достоверность выявленной корреляции: NS – статистически недостоверна, *p <0,05, ** p <0,001; ○ – корреляция c % нежизнеспособных форм; a – корреляция с долей морфологически аномальных форм
Note. Significance of the revealed correlation: NS - statistically insignificant, * p <0,05, ** p <0,001; ○ – correlation with% of non-viable forms; a - correlation with the proportion of morphologically abnormal forms
Ни одно из представленных исследований не выявило взаимосвязи между объемом эякулята и уровнем ФДС. Слабая отрицательная корреляция между концентрацией сперматозоидов и уровнем ФДС выявлена в двух из 11 представленных исследований [15, 16]. Значимая отрицательная корреляция доли прогрессивно подвижных сперматозоидов с уровнем ФДС отмечена в 6 исследованиях, при этом уровень связи варьировал от слабой до умеренной [17-20, 21]. Умеренная отрицательная связь доли морфологически нормальных форм и уровня ФДС наблюдалась в 4 исследованиях, в одном исследовании имела место слабая отрицательная корреляция, а в 5 исследованиях связи между морфологией сперматозоидов и уровнем ФДС не выявлено [10, 15, 20, 22-24]. В одном из представленных исследований продемонстрирована слабая положительная корреляция уровня ФДС с долей аномалий головки в структуре морфологических дефектов [22], в то время как результаты проведенного нами исследования не выявили связи между этими параметрами.
Особого внимания заслуживает исследование P.J. Stahl и соавт., где одни и те же пробы спермы исследовались с использованием сразу двух методов оценки ФДС: SCSA (Sperm chromatin structure assay) и TUNEL [16]. Изучение корреляция уровня ФДС и стандартных параметров спермы показало разные результаты для каждого из методов. Результаты SCSA демонстрировали достоверную умеренную корреляцию с концентрацией сперматозоидов и общей подвижностью сперматозоидов, в то время как результаты TUNEL коррелировали только с общей подвижностью сперматозоидов, и корреляция была очень слабой (табл. 4). Результаты данного исследования ставят под сомнение возможность сравнения результатов исследований, использующих разные методы оценки уровня ФДС.
В определенной степени использование различных методов оценки ФДС могло бы объяснить противоречивые данные исследований, оценивающих корреляцию уровня ФДС и параметров стандартного спермиологического исследования. Прямые (TUNEL) и непрямые (SCD (Sperm Chromatin Dispersion), SCSA) методы оценки ФДС имеют концептуальное различие. Непрямые методы, являются мерой «потенциального» повреждения ДНК сперматозоидов, в отличие от прямых методов, выявляющих «реальное» повреждение ДНК сперматозоидов [25]. Сопоставление результатов методов противоречивы. В рассмотренном ранее исследовании P.J. Stahl и соавт. результаты SCSA слабо коррелировали с результатами TUNEL (г= 0,31, p <00001), а вероятность того, что результаты анализа, выполненного одним методом, продемонстрируют нормальные значения, а при исследовании другим методом выявят повышенную ФДС – высокая (41%) [16]. В то же время ряд других исследований, со значительно меньшим объемом выборки, демонстрирует противоположный результат – высокую корреляцию результатов SCSA и TUNEL (коэффициент корреляции от 0,71 до 0,99) [25-27].
При этом, если мы обратимся к 3 исследованиям, использующим для оценки ФДС метод TUNEL, который применен в настоящем исследовании, то увидим, что их результаты так же не сопоставимы [16, 17, 23].
В наиболее крупном из представленных исследовании S. Belloc и соавт. изучалась корреляция уровня ФДС и стандартных параметров спермы у 1084 мужчин с изолированными формами патозооспермии (астенозооспермия, тератозооспермия, олигозооспермия). Корреляция отмечена только между уровнем ФДС и прогрессивной подвижностью сперматозоидов в группах с изолированной астено- и тератозооспермией. Кроме этого, высокий уровень ФДС (> 30%) достоверно чаще (p <0,00001) наблюдался у мужчин с астенозоооспермией (31%) по сравнению с пациентами с олигозооспермией (18%) и тератозооспермией (19%) [17]. Интересные данные получены в другом исследовании, где оценивалась связь между уровнем ФДС и жизнеспособностью сперматозоидов. Исходная выборка состояла из 50 пациентов с некрозооспермией и 20 пациентов с нормальным уровнем жизнеспособных сперматозоидов, что безусловно не позволяет экстраполировать результаты полученного исследования на мужскую популяцию в целом. Результаты исследования продемонстрировали сильную положительную связь доли нежизнеспособных сперматозоидов с уровнем ФДС (r = 0,878; p = 0,001). Кроме того, была выявлена статистически значимая отрицательная корреляция между уровнем ФДС и подвижностью сперматозоидов (r = – 0,646; р = 0,001), а также положительная корреляция ФДС с долей морфологически аномальных сперматозоидов (r = 0,434; р = 0,001) [23].
Определенный вклад в высокую вариабельность результатов исследований с использованием одного и того же метода оценки ФДС вносит отсутствие методологической стандартизации методов оценки ФДС [28]. Из трех исследований, использующих для оценки ФДС метод TUNEL, только в одном применяли проточную цитометрию [17], два других исследования использовали флюоресцентную микроскопию [16,23] для идентификации разрывов ДНК.
В нашем исследовании не выявлено взаимосвязи уровня ФДС с возрастом мужчин, в то время как большинство исследований демонстрирует повышение уровня ФДС с увеличением возраста [29,30]. Полученные результаты, вероятно, связаны с неоднородной возрастной структурой выборки – возраст 74% мужчин, находился в диапазоне от 30-40 лет, 14% в интервале от 20 до 30 лет, 9% в возрасте от 40 до 50 лет и лишь у 3% был возрасте старше 50 лет. Существенным ограничением нашего исследования является то, что мы не выявляли факторы образа жизни (курение, потребление алкоголя, тепловые процедуры) и сопутствующую патологию (варикоцеле, ожирение), которые потенциально могли повлиять на уровень ФДС и исказить результаты корреляционного анализа.
ВЫВОДЫ
Результаты нашего исследования демонстрируют взаимосвязь между уровнем ФДС и долей прогрессивно-подвижных форм сперматозоидов. Тем не менее, слабый характер выявленной взаимосвязи диктует необходимость рассматривать исследование ФДС как самостоятельный тест в оценке мужской фертильности.
ЛИТЕРАТУРА
Прикрепленный файл | Размер |
---|---|
Скачать статью | 2.08 Мб |