Применение бесклеточного матрикса донорской артерии для пластики стриктур заднего отдела уретры

ВВЕДЕНИЕ

Стриктура уретры представляет собой обструктивное поражение мочеиспускательного канала, сопровождающееся симптомами со стороны нижних отделов мочевых путей – затрудненное мочеиспускание, дискомфорт и т.д. [1]. Это заболевание представляет собой значимую медицинскую проблему, а его распространенность в развитых странах достигает до 6 случаев на 1000 лиц мужского пола [2]. Основными причинами развития стриктур уретры являются ятрогенные повреждения – 33% (при катетеризации, эндоскопических процедурах и др.), травмы – 19% и постинфекционные осложнения (в т.ч. постгонорейные) [3]. Выбор метода лечения зависит от локализации стриктуры, ее протяженности, сопутствующей патологии и количества ранее перенесенных операций [4].

Тканевые бесклеточные матриксы являются перспективными биоматериалами для применения в реконструктивной хирургии и позволяют решить ряд проблем, связанных с имплантацией синтетических материалов. Так, в частности, при деградации и вытеснении трансплантата тканями реципиента не образуются потенциально токсичные продукты деградации, в отличие, например, от матриксов на основе полигликолиевой кислоты [5]. Важно, что свободные лоскуты, представленные тканевыми бесклеточными матриксами, являются одобренным для клинического применения биоматериалом (главным образом, для пластики кожи) [6]. Относительно аугментационной уретропластики известны клинические и экспериментальные исследования применения бесклеточных лоскутов в лечении стриктур передней уретры и гипоспадии [7, 8]. На основе изучения литературы в качестве свободного лоскута для заместительной пластики уретры был выбран бесклеточный матрикс как наиболее безопасный и изученный материал для гетеротопической ксенотрансплантации.

Цель настоящего исследования – изучить возможность применения бесклеточного матрикса донорской артерии в качестве свободного плоского лоскута для заместительной уретропластики на модели лабораторных животных (кроликов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения материала исследования использовали кровеносные сосуды – артерию чревного ствола и коронарную артерию – которые изымали от посмертных доноров в асептических условиях. На каждый изъятый донорский сосуд составляли сопроводительный лист. Изъятие донорского биоматериала проводили в соответствии с Федеральным законом от 21.11.2011 № 323-ФЗ ст. 47 и ст. 66, ред. от 08.06.2020 «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации», при координации с патологоанатомическим отделением ФМБЦ ГНЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России. После изъятия сосуды транспортировали в стерильном растворе 0,9% NaCl с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина («ПанЭко», Россия) и 2,5 мкг/мл амфотерицина Б (Bharat Serums & Vaccines, Индия) на льду.

Детергентно–ферментативная перфузионная децеллюляризация

Для обеспечения перфузии донорские артерии фиксировали в статичных трубчатых стеклянных камерах с внутренним диаметром 3,5 – 5,5 мм (EbersMedical, Испания). Детергентно-ферментативную децеллюляризацию проводили в соответствии со следующим протоколом:

1. Перфузия 0,5% Тритон х100 (Santa-Cruz, США), 0,5% деоксихолат натрия (NaDOC) (Sigma-Aldrich) проводилась в течение 2 суток;
2. 0,05% Трипсин-ЭДТА (Gibco, Великобритания) – в течение 2 часов;
3. Для инактивации трипсина использовали DMEM с низкой глюкозой (Biological Industries, Израиль) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина – в течение 24 часов;
4. Раствор 300 ЕД/мл ДНКазы I (AppliChem, Германия) в 40 mM Tris–HCl, 10 mM MgCl2*6H2O, 10 mM NaCl – в течение ночи;
5. PBS (фосфатный буфер, Sigma-Aldrich) c добавлением 1% пенициллина-стрептомицина и 2,5 мкг/мл амфотерицина B – в течение 2 суток.

Сосудистые матриксы замораживали в реополиглюкине («Биохимик», Россия) с использованием EVA–мешков (OrigenBiomedical, США) и хранили при температуре минус 800С. Перед проведением операции лабораторному животному бесклеточные сосудистые матриксы размораживали, трехкратно промывали водой для инъекций (ООО «Ист-Фарм», Россия) и помещали в 1хPBS c добавлением цефазолина (5 мг/мл) при температуре плюс 4°С.

Для оценки качества децеллюляризации матриксов использовали следующие методы: гистологическое исследование с окрашиванием гематоксилином-эозином (Г-Э) для выявления остаточных ядер клеток, иммуногистохимическое исследование (ИГХ) с антителами к коллагену I типа внеклеточного матрикса (моноклональные антитела к коллагену I типа крысы и кролика, Dako, Дания), окрашивание DAPI (МetaSystemsProbes, Германия).

При оценке окрашенных Г-Э гистологических срезов критерием эффективности децеллюляризации являлось отсутствие морфологически различимых ядер в видимом поле зрения, не регистрируемых алгоритмами детекции ПО QuPath [9]. Первичный анализ изображений гистологических препаратов, окрашенных DAPI, проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axiovert (Carl Zeiss, Германия) под увеличением 10х. Критерием эффективности децеллюляризации являлось отсутствие морфологически различимых ядер с выраженными границами или фрагментированных ядер.

Для оценки остаточного количества геномной ДНК из фрагментов децеллюляризированных матриксов выделяли ДНК с использованием коммерческого набора Qiagen DNAeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, США). Исследование проводили в триплетах. Концентрацию ДНК в полученных препаратах определяли на спекторофотометре SmartSpec (BioRad, США).

Для создания модельного дефекта уретры и реконструкции дефекта использовали 7 кроликов самцов породы «Советская шиншилла» с массой тела 4,5-5,0 кг, полученные из питомника лабораторных животных «Рапполово» (НИЦ «Курчатовский институт» – ФГУП ПЛЖ «Рапполово»), имеющих соответствующее ветеринарное свидетельство и прошедших 14-суточный карантин. Исследование осуществлялось в соответствии с правилами лабораторной практики при проведении доклинических экспериментов в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96) и с положением Европейской Конвенции о защите позвоночных животных. Перед операцией кроликам выполняли внутримышечную анестезию смесью ксилазина («Ксила», Interchemie Werken, Нидерланды) и золетила 100 (Virbac, Франция) по 75 мг каждого.

Порядок послеоперационного наблюдения за лабораторными животными

В качестве стандартной терапии проводили катетеризацию мочевого пузыря для постоперационного дренирования уретры в течение 14 дней под прикрытием антибактериальной терапии внутримышечным введением препарата «Байтрил» 2,5% раствора для инъекций (BAYER, Германия) из расчета 0,2 мл на 1 кг веса животного. За животными наблюдали в течение 6 месяцев после операции, при мониторинге общего состояния животных оценивали вес, мочеиспускание, проводили взятие венозной периферической крови для биохимического измерения креатинина, мочевины и Cреактивного белка.

При оценке определяемых биохимических показателей крови ориентировались на нормы для С-реактивного белка (3,90±0,70 мг/л), креатинина (44,2 – 221 μмоль/л), мочевины (10±0,5 мМоль/л) [10–12].

Для проведения инструментальных методов исследования кроликам проводили внутримышечную анестезию смесью ксилазина («Ксила», Interchemie Werken, Нидерланды) и золетила 100 (Virbac, Франция) по 75 мг каждого. Компьютерную томографию (КТ) с цистоуретрографией проводили с использованием контрастного вещества «Ультравист» (Bayer, Германия) и магнитно-резонансную томографию (МРТ) – «Гадовист» (Bayer, Германия) через 5 месяцев после операции. Выполнялись обзорные снимки органов мочеполовой системы и, по результатам полученных DICOM– изображений, создавали трехмерную реконструкцию уретры с локализацией кавернозных тел. Также, проводили МРТ в аксиальной и сагиттальной плоскостях. На получаемых МРТ-срезах отмечали попадание в мочевой пузырь контраста и опорожнение мочевого пузыря.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оценка эффективности децеллюляризации матриксов

При анализе гистологических препаратов бесклеточных матриксов донорских сосудов не обнаруживали ни единичных ядер клеток, ни их фокусов. При окрашивании DAPI морфологически различимые ядра клеток с очерченными границами также не определялись. Для качественной оценки сохранности коллагена I типа после децеллюляризации матриксов проводили ИГХ с помощью которой отмечалась положительная реакция на коллаген I типа во всей толще бесклеточного матрикса (рис. 1).

Рис. 1. Морфологическая оценка качества децеллюляризации матриксов: а, б – окрашивание гематоксилин – эозином, 100Х; в, г – ИГХ на коллаген I типа, 100Х; д, е – окрашивание DAPI, 10Х. а, в, д – нативная сосудистая ткань; б, г, е – препараты децеллюляризированных сосудистых матриксов
Fig. 1. Morphological assessment of the quality of matrix decellularization: a, b – hematoxylin – eosin staining, 100X; C, d-IGX for type I collagen, 100X; d, e-DAPI staining, 10X. a, C, d-native vascular tissue; b, d, e – preparations of decellularized vascular matrices

Содержание ДНК в препаратах децеллюляризированных сосудистых тканей составило 42,3±8,05 нг/мг влажного веса ткани, что находится в рамках референсного значения для беклеточных матриксов (50 нг/мг ткани) используемого как критерий для оценки потенциальной иммуногенности биоматериалов [13].

Моделирование дефекта слизистой уретры. Заместительная уретропластика с использованием свободного донорского бесклеточного лоскута («on–lay» уретропластика)

После обработки операционного поля по уретре до мочевого пузыря проводили уретральный катетер Folеy 6 Ch. Далее производили циркулярное рассечение наружного листка крайней плоти. Кожу полового члена сдвигали проксимально. Продольным разрезом по вентральной поверхности полового члена осуществляли доступ к пенильному отделу уретры. После мобилизации уретры от кавернозных тел на протяжении выполняли уретротомию для создания дефекта слизистой уретры длиной 1,0 см, при этом дефект был локализован в заднем отделе уретры. Далее фиксировали бесклеточный лоскут донорской артерии к белочной оболочке со стороны смоделированного дефекта посредством наложения лоскут-узловых швов. Затем непрерывными обвивными швами Monosyn 7/0 (B.Braun, Германия) выполняли заднюю («on-lay») уретропластику вышеупомянутым лоскутом. Послойное ушивание раны проводили узловыми швами Polysorb 5/0 (Covidien, Швейцария). Уретральный катетер Folеy 6 Ch оставляли в мочевом пузыре и фиксировали к животу, катетер удаляли на 14 сутки после операции (рис. 2).

Рис. 2. Создание модельного дефекта слизистой уретры (задняя уретротомия) и заместительной уретропластики с использованием донорского бесклеточного лоскута коронарной артерии. а – бесклеточный лоскут донорской артерии; б – фиксация лоскута к белочной оболочке, проведение уретропластики непрерывными обвивными швами; в – проведение катетера Фолея 6 Ch от отверстия уретры до мочевого пузыря
Fig. 2. Creation of a model defect of the urethral mucosa (posterior urethrotomy) and replacement urethroplasty using a donor cell-free flap of the coronary artery. a-cell-free flap of the donor artery; b – fixation of the flap to the protein membrane, urethroplasty with continuous wrapping sutures; C-Foley catheter 6 Ch from the opening of the urethra to the bladder

В ходе послеоперационного наблюдения отмечали нормальную двигательную активность животных, нормальное мочеиспускание, не наблюдали потерю веса. Уровни С-реактивного белка, креатинина и мочевины в периферической крови через 5 месяцев после операции были в пределах нормы: 0,285±0,04839 мг/л, 93,5±8,057 мкМ/л, 8,35±1,355 мM/л, соответственно.

По результатам КТ с цистоуретрографией уретры на 5-й месяц после операции была получена трехмерная реконструкция уретры с кавернозными телами (рис. 3).

Рис. 3. Реконструкция уретры на основе КТ снимков: а – трехмерная модель уретры; б – трехмерная модель уретры с локализацией кавернозных тел. Желтым цветом отмечена уретра, красным – кавернозные тела
Fig. 3. Reconstruction of the urethra based on CT images: a-three-dimensional model of the urethra; b-three-dimensional model of the urethra with localization of cavernous bodies. Yellow marks the urethra, red marks the cavernous bodies

Рис. 4. МРТ-срезы органов таза: а – срез в сагиттальной плоскости, хорошо прослеживается локализация мочевого пузыря, половых органов и уретры с введенным контрастным веществом; б – срез в аксиальной плоскости.
Fig. 4. MRI sections of the pelvic organs: a – section in the sagittal plane, the localization of the bladder, genitals and urethra with the introduced contrast agent is well traced; b – section in the axial plane

В качестве способа лечения модельного дефекта в нашей работе была выбрана заместительная пластика с использованием свободного лоскута, поскольку пластика с использованием лоскута на сосудистой ножке сопряжена со значительными трудностями [14].

Бесклеточный лоскут был выбран в качестве материала для заместительной уретропластики ввиду высокой частоты применения материалов данного вида в реконструктивных операциях. Так, например, в качестве свободных бесклеточных лоскутов в уретропластике применяются подслизистая оболочка тонкого кишечника свиньи, дермальный матрикс, матриксы амниотической мембраны и подслизистой мочевого пузыря [7, 15-17]. Однако, важно отметить, что применение свободных лоскутов, представленных бесклеточными оболочками сосудов, изучено недостаточно. В Российской Федерации только одна публикация описывает применение децеллюляризированного матрикса трупного сосуда для лечения стриктуры уретры у пациента [18]. Таким образом, изучение возможности применения бесклеточного сосудистого матрикса в качестве свободного лоскута для заместительной пластики представляется актуальным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе показана возможность применения бесклеточного матрикса донорских артерий в качестве свободного лоскута для заместительной пластики дефекта задней уретры у кролика. Показано, что заместительная пластика стриктуры с использованием данного лоскута безопасна и эффективна.

ЛИТЕРАТУРА

1. Рыжкин А.В., Мамедов Э.А., Глухов В.П., Ильяш А.В. Хирургическое лечение посттравматических стриктур уретры. Образовательный вестник «Сознание» 2017; 12(12):237-239. [Ryizhkin A.V., Mamedov E.A., Gluhov V.P., Ilyash A.V. Hirurgicheskoe lechenie posttravmaticheskih striktur uretryi. Obrazovatelnyiy vestnik «Soznanie» = Educational bulletin «Consciousness» 2017;12(12):237-239. (In Russian)].
2. Суховерхов А.О., Капсаргин Ф.П., Окладников А.Ю. Результаты лечения больных со стриктурами уретры различной локализации. Сибирское медицинское обозрение 2015;6(96):88-91. [Suhoverhov A.O., Kapsargin F. P., Okladnikov A.Yu. Rezultatyi lecheniya bolnyih so strikturami uretryi razlichnoy lokalizatsii. Sibirskoe meditsinskoe obozrenie = Siberian Medical Review 2015;6(96):88-91. (In Russian)].
3. Hampson L.A., McAninch J.W., Breyer B.N. Male urethral strictures and their management. Nat Rev Urol 2014;11(1):43-50.
4. Котов С.В. Новые методы уретропластики при стриктурах уретры у мужчин. Анналы хирургии 2015;4:9-11. [Kotov S.V. Novyie metodyi uretroplastiki pri strikturah uretryi u muzhchin. Annalyi hirurgii = Annals of Surgery 2015;4:9-11. (In Russian)].
5. Клабуков И.Д. Многослойная тканеинженерная конструкция на основе биодеградируемых и биосовместимых материалов для восстановления поврежденных желчных путей. М.: Автореф. дисс. к.б.н. 2018(26). [Klabukov I.D. Mnogosloynaya tkaneinzhenernaya konstruktsiya na osnove biodegradiruemyih i biosovmestimyih materialov dlya vosstanovleniya povrezhdennyih zhelchnyih putey. M.: Avtoref. diss. k.b.n. 2018(26). (In Russian)].
6. Deneve J.L., Turaga K.K., Marzban S.S., Puleo CA, Sarnaik AA, Gonzalezet RJ, et al. Singleinstitution outcome experience using alloderm(r) as temporary coverage or definitive reconstruction for cutaneous and soft tissue malignancy defects. Am. Sur 2013;79(5):476-482.
7. Lin D., Wang G., Song H., Qu Y, Liu P, Lianget H, et al. Use of Acellular Dermal Matrix for Urethroplasty Coverage in Proximal Hypospadias Repair: a Pilot Study. Adv Ther 2020(37):1425-1435.
8. Васютин И.А., Люндуп А.В., Винаров А.З. Реконструкция уретры с помощью технологий тканевой инженерии. Вестник Российской академии медицинских наук 2017;72(1):17-25. [Vasyutin I.A., Lyundup A.V., Vinarov A.Z... Rekonstruktsiya uretryi s pomoschyu tehnologiy tkanevoy inzhenerii. Vestnik Rossiyskoy akademii meditsinskih nauk = Annals of the Russian Academy of Medical Sciences 2017;72(1):17-25. (In Russian)].
9. Bankhead P., Loughrey M.B., Fernandez J.A., Dombrowski Y, McArt DG, Dunne PD, et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep 2017;4(7):1-7.
10. Севастьянов В.И., Духина Г.А., Григорьев А.М., Перова Н.В., Кирсанова Л.А., Скалецкий Н.Н., Ахаладзе Д.Г., Готье С.В. Функциональная эффективность биомедицинского клеточного продукта для регенерации суставного хряща (экспериментальная модель остеоартроза). Вестник трансплантологии и искусственных органов 2015;17(1):86-96. [Sevastyanov V.I., Duhina G.A., Grigorev A.M., Perova N.V., Kirsanova L.A., Skaletskiy N.N., Ahaladze D.G., Gote S.V. Funktsionalnaya effektivnost biomeditsinskogo kletochnogo produkta dlya regeneratsii sustavnogo hryascha (eksperimentalnaya model osteoartroza). Vestnik transplantologii i iskusstvennyih organov = Russian Journal of Transplantology and Artificial Organs 2015;17(1):86-96. (In Russian)].
11. Melillo A. Rabbit Clinical Pathology. J Exot Pet Med 2007;16(3):135-145.
12. Абрашова Т.В., Гущин Я.А., Ковалева М.А., Рыбакова А.В., Селезнева А.И., Соколова А.П. и др. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных; под ред. Макарова В.Г., Макаровой М.Н. Cанкт-Петербург: Лема, 2013:116. [Abrashova T.V., Guschin Ya.A., Kovaleva M.A., Ryibakova A.V., Selezneva A.I., Sokolova A.P. i dr. Fiziologicheskie, biohimicheskie i biometricheskie pokazateli normyi eksperimentalnyih zhivotnyih; pod red. Makarova V.G., Makarovoy M.N. Cankt-Peterburg: Lema, 2013:116. (In Russian)].
13. Губарева Е.А., Сотниченко А.С., Гилевич И.В., Маккиарини П. Морфологическая оценка качества децеллюляризации сердца и диафрагмы крыс. Гены и клетки 2012;7(4):38-45. [Gubareva E.A., Sotnichenko A.S., Gilevich I.V., Makkiarini P. Morfologicheskaya otsenka kachestva detsellyulyarizatsii serdtsa i diafragmyi kryis. Genyi i kletki=Genes and Cells 2012;7(4):38-45. (In Russian)].
14. Guo H.L., Jia Z.M., Wang L., Bao XQ, Huang YC, Zhouet JM, et al. Tubularized urethral reconstruction using a prevascularized capsular tissue prelaminated with buccal mucosa graft in a rabbit model. Asian J Androl 2019;21(4):381-386.
15. Mangera A., Chapple C.R. Tissue engineering in urethral reconstruction–an update. Asian J androl 2013;15(1):89-92.
16. Ramuta T. Ž., Kreft, M. E. Human Amniotic Membrane and -Derived Cells: How Far Are We from Their Use in Regenerative and Reconstructive Urology Amniotic Membrane? Cell transplantation 2018;27(1):77-92.
17. de Kemp V, de Graaf P, Fledderus JO, Ruud Bosch JL, de Kort MO, et al. Tissue engineering for human urethral reconstruction: systematic review of recent literature. PLoS One 2015;10(2):1-14.
18. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Николенко В.Н., Шехтер А.Б., Винаров А.З., Истранов Л.П. и др. Тканевая инженерная замещающая уретропластика на основе децеллюляризованного сосудистого матрикса и аутологичных клеток слизистой оболочки щеки: первый опыт. Урология 2015; 3: 4-10 [Glybochko P.V, Aljaev J.G., Nikolenko V.N., Shehter A.B., Vinarov A.Z., Istranov L.P., et al. Tissue engineered substitution urethroplasty based on decellularized vascular matrix and autologous cells of the buccal mucosa: The First Experience. Urologiia 2015(3):4-10. (In Russian)].