Способ создания модели варикоцеле в хроническом эксперименте

ВВЕДЕНИЕ

Варикоцеле представляет собой варикозное расширение и извитость вен гроздевидного сплетения, сопровождающееся интермиттирующим или перманентным венозным рефлюксом [1-3]. Согласно данным мировой статистики, варикоцеле диагностируют у каждого седьмого подростка старше 15 лет, а в совокупности им страдает до 15% всех мужчин [4, 5]. Доля первичного бесплодия в связи с варикоцеле достигает 35%, а для вторичного бесплодия – 70-81% [3, 6-9]. В настоящее время устранение варикоцеле является одним из первых шагов в лечении бесплодия у мужчин [10-12]. На формирование патоспермии оказывают влияние такие патогенетические факторы, как гипоксия, локальная гипертермия, оксидативный стресс, гормональная дисфункция яичек, что приводит к прогрессирующему поражению сперматогенного эпителия и снижению мужской фертильности [4, 13, 14].

Нарушения показателей спермограммы у бесплодных мужчин с варикоцеле могут варьировать от нормозооспермии до полной азооспермии [15]. Исследованиями доказано, что оксидативный стресс (ОС) и сопряженная с ним усиленная выработка активных форм кислорода (АФК) являются ключевыми патогенетическими факторами повреждения сперматогенного эпителия яичек при варикоцеле [4, 13-17]. Другие фундаментальные исследования демонстрируют, что у 45% мужчин с клинически выявленным (пальпируемым) варикоцеле нет ухудшения параметров эякулята, а 80% мужчин с варикоцеле являются фертильными [1, 10, 11, 18]. Таким образом, несмотря на прогресс в изучении варикоцеле, остаются трудности понимания связи заболевания с риском развития бесплодия. Это определяет актуальность дальнейшего изучения и создания экспериментальных моделей данного заболевания на животных с целью изучения механизма его возникновения, патофизиологии ассоциированных с ним состояний, а также решения вопроса профилактики и лечения.

Существует несколько способов создания модели варикоцеле у лабораторных животных (крыса, кролик). Абсолютное большинство методов основано на сужении просвета левой почечной вены лигатурой на 1/2-2/3 от исходного диаметра [19-23]. Имеется так же модифицированный опыт микрохирургического лигирования гонадных вен у места впадения в общую подвздошную вену в сочетании с частичной окклюзией левой почечной вены [22, 24].

Известно деструктивное действие эстрогена и прогестерона на венозную стенку посредством разрушения коллагеновых и эластических волокон, вызывающее варикозное расширение вен. Также необходимо помнить о структурных особенностях самой венозной стенки при варикоцеле. Данные нарушения рассматриваются как частное проявление системной недостаточности соединительной ткани при синдроме дисплазии соединительной ткани (ДСТ). Неполноценность мезенхимальных структур в рамках синдрома ДСТ при варикоцеле, как и при других формах варикоза, выступает в качестве системного причинного фактора [6, 23, 25, 26].

Цель исследования – создание модели стойкого варикоцеле у лабораторных животных в хроническом эксперименте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Анализ литературных данных об экспериментальных моделях варикоцеле

Проанализированы данные научных статей с 2000 по 2023 год, опубликованные в базе данных PubMed и электронной научной библиотеки eLibrary, главным ключевым словом являлось «варикоцеле», дополнительные ключевые слова: «животные», «модель варикоцеле», «хронический эксперимент» – использовались исключительно для ограничения поиска публикаций. Были включены только оригинальные исследования на животных.

Экспериментальная часть

Проведен хронический эксперимент на 20 кроликахсамцах породы Серый великан (Oryctolagus cuniculus) в возрасте 1,5 месяцев. Средний вес животного составил 1,8±0,2 кг. К вязке животные не допускались. Эксперимент проводили в соответствии с «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». Эксперимент выполняли на базе кафедры анатомии, гистологии, физиологии и патологической анатомии факультета ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета.

Всем животным при ультразвуковом дуплексном ангиосканировании визуализировали вены семенного канатика. Далее животные были разделены на 2 группы: в первую группу (группу контроля) вошли 10 кроликов, модель варикоцеле у которых создавалась посредством сужения просвета левой почечной вены на 1/2-2/3 исходного диаметра. Другим 10 лабораторным животным (вторая группа) за сутки до операции вводили парентерально гонадотропин 300 ед/кг массы тела и 0,2 мл 1%-го раствора прогестерона. Начиная с первых предоперационных суток, продолжительность курса медикаментозного воздействия составляла 10 суток. На следующие сутки осуществляли сужение просвета левой почечной вены на 1/2-2/3 исходного диаметра [23].

Животных оперировали под общим обезболиванием с применением препаратов Золетил в дозе 0,25/кг и Рометар в дозе 0,25/кг. Лапаротомию выполняли левым боковым доступом. Петли тонкой кишки отводили вентрально. В забрюшинной клетчатке пальпаторно находили левую почку. В связи с тем, что у кролика подвижность почки составляет 6-8 см, последнюю мануально фиксировал ассистент. Проводили диссекцию сосудистой ножки почки от ее ворот на протяжении до впадения в нижнюю полую вену. Длина почечной вены в среднем составляла 5,5-6,5см, а диаметр – 3 мм (рис. 1). Следующим этапом было наложение суживающей просвет левой почечной вены лигатуры дистальнее (относительно кровотока) места впадения левой внутренней семенной вены (рис. 2).

Рис. 1. Диссекция сосудистой ножки почки
Fig. 1. Dissection of the renal vascular pedicle

Рис. 2. Селективное сужение просвета левой почечной вены на 1/2-2/3 исходного диаметра
Fig. 2. Selective narrowing of the lumen оf the left renal vein by 1/2-2/3 original diameter

Для контроля за формированием варикоцеле до вмешательства, на 14-е, 30-е сутки, а также на 8, 12 и 24 неделях выполняли ультразвуковое исследование семенников в режиме серой шкалы и допплеровского картирования.

Критерием создания модели варикоцеле считали регистрацию при дуплексном ангиосканировании увеличения диаметра вен семенного канатика в два раза от исходного или сам факт их визуализации, или регистрация рефлюксной волны крови длительностью более 1 сек. Последнюю провоцировали мануальной компрессией брюшной полости, повышая таким образом внутрибрюшное давление (прием, заменяющий пробу Valsalva, в связи с тем, что волевое натуживание у животного невозможно). В первом случае речь идет о ситуации, когда до введения животного в эксперимент при ультразвуковом исследовании удалось визуализировать семенные вены. В связи с видовыми особенностями животного диаметр интересующих сосудов может составлять десятые доли миллиметра, что лежит вне разрешающих возможностей ультразвукового сканера. При этом после выполнения оперативного вмешательства и гормонального курса семенные вены расширились до степени, позволяющей их визуализировать.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ экспериментальных моделей варикоцеле

Отобрано 16 научных статей по моделированию варикоцеле у животных за период с 2000 по 2023 год с детализацией авторов, года публикации, способа создания модели варикоцеле, сроков формирования и сохранения модели (табл. 1). Основным лабораторным животным с экспериментальной моделью варикоцеле служила крыса, а способом моделирования варикоцеле – селективная частичная перевязка левой почечной вены. В двух случаях классическая методика была дополнена микрохиругической перевязкой ветвей семенной вены, идущей к левой общей подвздошной вене [22, 24]. Авторы обосновали данную модификацию более короткими сроками формирования и хронизации модели, что делает ее эффективной. Успешность создания такой модели, по данным авторов, составляет 85% и зависит в большей степени от вариабельности анатомии животного.

Таблица 1. Описание способов создания модели варикоцеле у лабораторных животных
Table 1. Description of methods for creating a model of varicocele in laboratory animals

В семи экспериментальных работах сроки формирования варикоцеле не зафиксированы. В девяти публикациях они составили от 4 до 12 недель. Сроки сохранения модели составили в среднем от 4 до 13 недель.

Экспериментальная часть

Во всех случаях к 14 суткам у кроликов выявляли расширенные семенные вены и по ним регистрировали рефлюкс. Максимальное расширение вен зарегистрировано спустя 30 суток (рис. 3).

Рис. 3. Эхограмма (а) и допплерограмма (б) на 30-сутки. При мануальной компрессии брюшной полости имеется рефлюкс по семенным венам кролика
Fig. 3. Echogram (a) and Dopplerogram (б) on the 30th day. With manual compression of the abdominal cavity, there is reflux through the spermatic veins of the rabbit

Сравнительная характеристика диаметра вен и регистрации рефлюкса представлена в таблице 2.

Таблица 2. Диаметр вен на уровне семенника в динамике
Table 2. Diameter of veins at the level of the testis in dynamics

В первой группе, где осуществляли изолированное сужение левой почечной вены, лишь в одном случае была зафиксирована семенная вена диметром 0,6 см. У остальных животных, включая вторую группу, определение диаметра вен на дооперационном этапе явилось невозможным. Венозного рефлюкса по венам семенников среди животных обеих групп зарегистрировано не было.

Спустя 14 суток от создания модели у всех животных в обеих группах визуализировались семенные вены, было зафиксировано расширение семенных вен без статистически значимой разницы между группами (p>0,05).

На 30-е сутки в группе гормонального воздействия зарегистрировано расширение семенных вен до 2,1 мм, в то время как в первой группе у 2 особей, по данным эходопплерографии, напротив, перестало определяться расширение вен и рефлюкс.

Общая тенденция эффекта закреплялась на 8 неделе наблюдения: при сохраняющемся расширении вен и наличии рефлюкса во второй группе отмечается возвращение диаметра семенных вен к их исходному диаметру в группе контроля (у 7 особей диаметр вен не определяется, и у всех 10 животных не регистрируется венозный рефлюкс).

На 12 и 24 неделях эксперимента в первой группе мы наблюдали полную адаптацию к новым условиям венозного оттока: у всех животных кровоток компенсировался, и измерение диаметра семенных вен и регистрация рефлюкса вновь стали недоступны, в то время как во второй группе эффект воздействия гонадотропина и прогестерона подтверждается относительно устойчивыми цифрами измерения диаметра вен и наличием венозного рефлюкса в 10 случаях, что говорит о хронизации и закреплении венозного застоя и формировании длительной модели варикоцеле.

В нашем эксперименте сроки формирования варикоцеле у лабораторного животного (кролик) составили 14 суток, а максимальная дилатация вен зарегистрирована спустя 30 суток. Сроки сохранения модели – 24 недели.

ОБСУЖДЕНИЕ

Бесспорно, варикоцеле, как один из основных факторов мужского бесплодия, требует углубленного изучения механизма его формирования, разработки методик лечения и профилактики этого патологического процесса непосредственно, а также состояний с ним связанных. В связи с этим актуален поиск оптимальной модели его изучения.

Первой удачной моделью варикоцеле считается созданное в 1979 году R. Kay и его коллегами индуцированное варикоцеле у обезьяны путем частичного лигирования левой почечной вены [41]. Результаты работы показали достоверное снижение количества сперматозоидов и локальное увеличение температуры семенников. В дальнейшем D. Saypol и соавт. воспроизвели модель на собаках, но в вышеуказанных моделях животных произошли реверсия нарушенных параметров эякулята и снижение степени дилатации гонадной вены [42]. Позднее в 1983 году R. Harrison совместно с коллегами провели аналогичную работу по созданию модели варикоцеле у обезьяны и выявили формирование сочетанной лимфатической недостаточности, что отдаляет нас от «идеальной» модели варикоцеле, поскольку добавляется фактор, не участвующий в естественном развитии заболевания [43]. Кроме того, в 1981 году D. Saypol и соавт. ввели экспериментальную модель крысы, также частично перевязав левую почечную вену [42]. С тех пор крысы стали самым распространенным лабораторным животным с экспериментальной моделью варикоцеле, что объясняется сходной венозной анатомией между человеком и крысой, когда возникает левостороннее варикоцеле.

Подобно анатомии человека, экспериментально индуцированное варикоцеле у крысы сопровождается расширением семенной вены и коллатералей. Морфологически сосудистые нарушения выражаются в изменении гладкомышечных клеток, дисплазии эндотелия, увеличении роста коллагеновых волокон и деградации эластических волокон. У большинства крыс внутренняя семенная вена более тонкая, и кровь из пуповинного сплетения сбрасывается в левую почечную вену, а более толстая ветвь – в левую общую подвздошную вену. Этот тазовый венозный дренаж может свести на нет повышенное венозное давление левой почечной вены [20, 21]. B. Najari и соавт. дополнили классическую методику микрохиругической перевязкой ветвей семенной вены, идущей к левой общей подвздошной. Такая модификация позволила добиваться формирования варикоцеле эффективнее в более короткие сроки, а также дала возможность его хронизации [22]. Успешность создания такой модели составляет 85% и зависит в большей степени от вариабельности анатомии животного [22, 44-45], а также представляет собой технически трудно выполнимую манипуляцию, требующую внедрения специальной оптики, оборудования для микрохирургических вмешательств и соответствующих навыков исследователя. Недостатками данных методик являются не всегда прогнозируемые сроки формирования варикоцеле и продолжительность результата, при этом единственным действующим фактором является флебогипертензия, что не в полной мере обеспечивает истинно варикозную трансформацию вен с расширением просвета и появлением извитости [22, 45].

Наша работа выполнена на кроликах: данные животные также имеют схожую анатомию с человеком, и во всех случаях достигалось формирование варикоцеле слева. Размер животного дал нам возможность выполнить все хирургические манипуляции без использования увеличительной техники и избежать при этом осложнений, таких как сосудистое кровотечение, перевязка мочеточника, с которыми сталкивались исследователи [20, 21, 26, 41-45]. Это также позволяет оценивать результаты с помощью стандартных неинвазивных методик визуализации без вывода животных из эксперимента.

Преимуществом данной модели мы считаем бо́льшую физиологичность, так как сужение только лишь левой почечной вены патогенетически не воспроизводит человеческую модель регионарной венозной почечной гипертензии, сохраняя отток через коллатерали. А высокая скорость воспроизведения и создание хронического эксперимента достигаются путем гормональной индукции процесса варикозного расширения вен, что является простым и экономически выгодным методом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предлагаемая модель эффективна и может быть использована в хроническом эксперименте до 6 месяцев и более для изучения влияния венозного полнокровия семенных вен на возникновение и течение патологических процессов в семеннике. Кроме того, возможно изучение эффективности потенциальных лечебных воздействий как на само варикоцеле, так и на патологические процессы, протекающие на его фоне и в связи с ним.

ЛИТЕРАТУРА

1. Su JS, Farber NJ, Vij SC. Pathophysiology and treatment options of varicocele: an overview. Andrologia 2021;53:e13576. https://doi.org/10.1111/and.13576.
2. Roque M, Esteves SC. Effect of varicocele repair on sperm DNA fragmentation: a review. Int Urol Nephrol 2018;50(4):583-603. https://doi.org/10.1007/s11255-018-1839-4.
3. Baichorov EH, Panchenko RI. Varicocele as a factor of violation of spermatogenesis and decrease in male fertility. Astrakhan Medical Journal 2023;18(1):6-16. https://doi.org/10.29039/1992-6499-2023-1-6-16.
4. Agarwal A. Finelli R, Durairajanayagam D, Leisegang K, Henkel R, Salvio G, Aghamajidi A, et al. Comprehensive Analysis of Global Research on Human Varicocele: A Scientometric Approach. World J Mens Health 2022;40:e28. https://doi.org/10.5534/wjmh.210202.
5. Rupin S, Ashok A, Parviz K, Rambhatla A, Saleh R, Cannarella R, et al. Consensus and Diversity in the Management of Varicocele for Male Infertility: Results of a Global Practice Survey and Comparison with Guidelines and Recommendations. World J Mens Health 2023;(1):164-97. https://doi.org/10.5534/wjmh.220048.
6. Цуканов А.Ю., Семикина С.П., Мустафаев Р.Ф. Варикоцеле как проявление синдрома дисплазии соединительной ткани. Урологические ведомости 2019;9(2):11-6. [Tsukanov A.Yu., Semikina S.P., Mustafayev R.F. Varicocele as a manifestation of connective tissue dysplasia syndrome. Urologicheskiye vedomosti = Urology Reports 2019;9(2):11-6. (In Russian)]. https://doi.org/10.17816/uroved9211-16.
7. Панченко И.А., Панченко Р.И., Байчоров Э.Х. Варикоцеле: оптимальный лечебно-диагностический подход и медицинская реабилитация репродуктивной функции. Курортная медицина 2014;(4):47-53. [Panchenko I.A., Panchenko R.I., Baichorov E.Kh. Varicocele: optimal treatment and diagnostic approach and medical rehabilitation of reproductive function. Kurortnaya meditsina = Resort Medicine 2014;(4):47-53. (In Russian)].
8. Жуков О.Б., Верзин А.В., Пеньков П.Л. Регионарная почечная венная гипертензия и левостороннее варикоцеле. Андрология и генитальная хирургия 2013;(3):29-37. [Zhukov O.B., Verzin A.V., Penkov P.L. Regional renal venous hypertension and left-sided varicocele. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and genital surgery 2013;(3):29-37. (In Russian)].
9. Chiba K, Fujisawa M. Clinical Outcomes of Varicocele Repair in Infertile Men: A Review. World J Mens Health 2016;34(2):101-9. https://doi.org/10.5534/wjmh.2016.34.2.101.
10. Jensen CFS, Ostergren P, Dupree JM, Ohl DA, Sonksen J, Fode M. Varicocele and male infertility. Nat Rev Urol 2017;14:523-33. https://doi.org/10.1038/nrurol.2017.98
11. Morini D, Spaggiari G, Daolio J, Melli B, Nicoli A, De Feo G, et al. Improvement of sperm morphology after surgical varicocele repair. Andrology 2021;9(4)1176-84. https://doi.org/10.1111/andr.13012.
12. Park JH, Pak K, Park NC, Park HJ. How Can We Predict a Successful Outcome after Varicocelectomy in Painful Varicocele Patients? An Updated Meta-Analysis. World J Mens Health 2021;39(4):645-53. https://doi.org/10.5534/wjmh.190112.
13. Finelli R, Leisegang K, Kandil H, Agarwal A. Oxidative Stress: A Comprehensive Review of Biochemical, Molecular, and Genetic Aspects in the Pathogenesis and Management of Varicocele. World J Mens Health 2022;40(1):87-103. https://doi.org/10.5534/wjmh.210153.
14. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine; Society for Male Reproduction and Urology. Report on varicocele and infertility: a committee opinion. Fertil Steril 2014;102(6):1556-60. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.10.007.
15. Sofikitis NV, Miyagawa I, Incze P, Andrighetti S. Detrimental effect of left varicocele on the reproductive capacity of the early haploid male gamete. J Urol 1996;156:267-70.
16. Agarwal A, Hamada A, Esteves SC. Insight into oxidative stress in varicocele-associated male infertility: part 1. Nat Rev Urol 2012;9:678-90. https://doi.org/10.1038/nrurol.2012.197.
17. Ferhat K, Fazilet K, Cem A. Experimental varicocele induces hypoxia inducible factor-1, vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis in the rat testis. J Urol 2004;172(3):1188-91. https://doi.org/10.1097/01.ju.0000135455.97627.15.
18. Hamada A, Esteves SC, Agarwal A. Insight into oxidative stress in varicocele-associated male infertility: part 2. Nat Rev Urol 2013;10:26-37. https://doi.org/10.1038/nrurol.2012.198.
19. Turner TT. The stady of varicocele through the use the animal models. Hum Reprod Update 2001;7(1):78-84. https://doi.org/10.1093/humupd/7.1.78.
20. Chen Q, Zhou R, Yang C, Jiang Q, Yuan H, Qiu X, et al. Ergothioneine attenuates varicocele-induced testicular damage by upregulating HSP90AA1 in rats. J Biochem Mol Toxicol 2023;37(4):e23301. https://doi.org/10.1002/jbt.23301.
21. Niloofar Dehdari Ebrahimi, Sara Shojaei-Zarghani, Ehsan Taherifard Sanaz. Protective effects of melatonin against physical injuries to testicular tissue: A systematic review and meta-analysis of animal models. Front Endocrinol 2023;14:1123999. https://doi.org/10.3389/fendo.2023.1123999.
22. Najari BB, Li PS, Ramasamy R, Katz M, Sheth S, Robinson B, Goldstein M. Microsurgical Rat Varicocele Model. J Urol 2014;191(2):548-53. https://doi.org/10.1016/j.juro.2013.08.011.
23. Цуканов А.Ю. Патент на изобретение. Способ моделирования варикоцеле. Заявка № 2005114330/14. [Tsukanov A.Yu. Patent for invention. Method for modeling varicocele. Application No. 2005114330/14. (In Russian)].
24. Zhou T, Cao H, Chen G, Yang B, Sun Y. Outcomes of experimental rat varicocele with and without microsurgery. BMC Urology 2015;15(1):19. https://doi.org/10.1186/s12894-015-0012-y.
25. Цуканов Ю.Т., Цуканов А.Ю., Щеглов А.Ю., Мозговой С.И. Патоморфологические аспекты варикозного поражения вен нижней половины туловища. Вестник Санкт-Петербургского университета 2006;(3):50-61. [Tsukanov Yu.T., Tsukanov A.Yu., Shcheglov A.Yu., Mozgovoy S.I. Pathomorphological aspects of varicose veins of the lower half of the body. Vestnik Sankt-Peterburgskogo universiteta = Bulletin of St. Petersburg University 2006;(3):50-61. (In Russian)].
26. Цуканов Ю.Т., Цуканов А.Ю., Баженов В.Н., Корниенко И.Ф., Василевич В.В. Медикаментозная коррекция негативных флеботропных эффектов гормонозаместительной терапии у женщин. Ангиология и сосудистая хирургия Журнал им. академика А.В. Покровского 2009;15(3):87-91. [Tsukanov Yu.T., Tsukanov A.Yu., Bazhenov V.N., Kornienko I.F., Vasilevich V.V. Drug correction of negative phlebotropic effects of hormone replacement therapy in women. Angiologiya i sosudistaya khirurgiya Zhurnal im. akademika A.V. Pokrovskogo = Angiology and Vascular Surgery Journal named after academician A.V. Pokrovsky 2009;15(3):87-91. (In Russian)].
27. Chang IY, Kim JH, Park KH, Yoon SP. Experimental varicocele induces p53-dependent germ cell apoptosis through activation of γ-H2AX. Urol Int 2010;85(2):216-20. https://doi.org/10.1159/000316356.
28. Arena S, Minutoli L, Arena F, Nicotina PA, Romeo C, Squadrito F, et al. Polydeoxyribonucleotide administration improves the intra-testicular vascularization in rat experimental varicocele. Fertil Steril 2012;97(1):165-8. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2011.10.007.
29. Najari BB, Li PS, Ramasamy R, Katz M, Sheth S, Robinson B, et al. Microsurgical rat varicocele model. J Urol 2014;191(2):548-53. https://doi.org/10.1016/j.juro.2013.08.011.
30. Katz MJ, Najari BB, Li PS, Goldstein M. The role of animal models in the study of varicocele. Transl Androl Urol 2014;3(1):59-63. https://doi.org/10.3978/j.issn.2223-4683.2014.01.07.
31. Guo WB, Yang C, Bian J, Xia H, Yang JK, Zhou QZ, et al. With a new clip technique surgically inducing varicocele in Sprague-Dawley rats. BMC Urol 2018;18(1):58. https://doi.org/10.1186/s12894-018-0350-7.
32. Lorian K, Kadkhodaee M, Kianian F, Abdi A, Seifi B. Administration of sodium hydrosulfide reduces remote organ injury by an anti-oxidant mechanism in a rat model of varicocele. Iran J Basic Med Sci 2020;23(2):236-43. https://doi.org/10.22038/ijbms.2019.39727.9412.
33. Akkan SS, İzgüt-Uysal VN, Çakır T, Özbey Ö, Üstünel İ. The effect of experimental varicocele on the apelin and APJ expressions in rat testis tissue. Tissue Cell 2020;63:101318. https://doi.org/10.1016/j.tice.2019.101318.
34. Hosseini M, Shaygannia E, Rahmani M, Eskandari A, Golsefid AA, Tavalaee M, et al. Endoplasmic Reticulum Stress (ER Stress) and Unfolded Protein Response (UPR) Occur in a Rat Varicocele Testis Model. Oxid Med Cell Longev 2020;2020:5909306. https://doi.org/10.1155/2020/5909306.
35. Antonuccio P, Micali A, Puzzolo D, Romeo C, Vermiglio G, Squadrito V, et al. Nutraceutical Effects of Lycopene in Experimental Varicocele: An «In Vivo» Model to Study Male Infertility. Nutrients 2020;12(5):1536. https://doi.org/10.3390/nu12051536.
36. Antonuccio P, Marini HR, Micali A, Romeo C, Granese R, Retto A, et al. The Nutraceutical NPalmitoylethanolamide (PEA) Reveals Widespread Molecular Effects Unmasking New Therapeutic Targets in Murine Varicocele. Nutrients 2021;13(3):734. https://doi.org/10.3390/nu13030734.
37. Babaei A, Asadpour R, Mansouri K, Sabrivand A, Kazemi-Darabadi S. Lycopene protects sperm from oxidative stress in the experimental varicocele model. Food Sci Nutr 2021;9(12):6806-17. https://doi.org/10.1002/fsn3.2632.
38. Karimi H, Asghari A, Jahandideh A, Akbari G, Mortazavi P. Effects of Metformin on Experimental Varicocele in Rats. Arch Razi Inst 2021;76(2):371-84. https://doi.org/10.22092/ari.2020.128136.1406.
39. Shaygannia E, Nasr-Esfahani MH, Sotoodehnejadnematalahi F, Parivar K. Is ferroptosis involved in ROS-induced testicular lesions in a varicocele rat model? Basic Clin Androl 2021;31(1):10. https://doi.org/10.1186/s12610-021-00125-9.
40. Dehdari Ebrahimi N, Shojaei-Zarghani S, Taherifard E, Dastghaib S, Parsa S, Mohammadi N, et al. Protective effects of melatonin against physical injuries to testicular tissue: A systematic review and meta-analysis of animal models. Front Endocrinol (Lausanne) 2023;14:1123999. https://doi.org/10.3389/fendo.2023.1123999.
41. Kay R, Alexander NJ, Baugham WL. Induced varicoceles in rhesus monkeys. Fertil Steril 1979;31:195-9.
42. Saypol DC, Howards SS, Turner TT, Miller Jr ED. Influence of surgically induced varicocele on testicular blood flow, temperature, and histology in adult rats and dogs. J Clin Invest 1981;68(1):39-45. https://doi.org/10.1172/jci110252.
43. Harrison RM, Lewis RW, Roberts JA. Testicular blood flow and fluid dynamics in monkeys with surgically induced varicoceles. J Androl 1983;4:256-60. https://doi.org/10.1002/j.1939-4640.1983.tb02363.x.
44. Dandia SD, Bagree MM, Vyas CP, Singh H, Pendse AK, Joshi KR. Experimental production of varicocele and its effects on testis. JAP J Sur 1979;4:372-8. https://doi.org/10.1007/bf02468639.
45. Cockett AT, Al-Juburi A, Altebarmakian V, Vergamini RF, Caldamone AA. The varicocele: new experimental and clinical data. Urol 1980;15:492-5. https://doi.org/10.1016/0090-4295(80)90011-4.