ВВЕДЕНИЕ

В последнее десятилетие наблюдается рост заболеваемости почечно-клеточным раком (ПКР), происходящим из эпителиальных клеток почечных канальцев. В мире ПКР занимает 9 место по распространенности онкологических заболеваний [1]. Несмотря на достижения в области методов визуализации данной патологии, позволяющие выявлять до 50-60% случаев локализованного ПКР, у 25-30% больных уже при первичном обследовании, выявляют отдаленные метастазы [1, 2].

Развитие эффективных методов лечения метастатических стадий ПКР в настоящее время связывают с внедрением в клиническую практику иммунотерапии. ПКР представляет собой одну из наиболее иммуно-инфильтрированных опухолей с высоким уровнем инфильтрации Т-клетками, содержащую опухолетрансформированные макрофаги (ТАМ) и иммунные инфильтраты [3]. Цитокины и хемокины, экспрессируемые ТАМ, подавляют противоопухолевые иммунные механизмы и вызывают прогрессию опухолевого роста. Высокую эффективность при лечении заболевания показали комбинированные стратегии лечения, сочетающие антиангиогенную терапию и иммунотерапию, основанную на подавлении иммунных контрольных точек («контрольные точки» – молекулы на определенных иммунных клетках, которые необходимо активировать (или инактивировать) для начала иммунного ответа) [4]. В последние годы установлено, что исследование содержания молекулярно-генетических биомаркеров в сыворотке крови и тканях, характеризующих активность инфильтрирующих опухоль иммунных клеток или опухолевое микроокружение (МкО), дает возможность провести оценку эффективности иммуногенных эффектов противоопухолевой терапии, а также прогнозировать развитие ее осложнений [5]. Одним из ведущих участников формирования МкО являются белки-медиаторы иммунорегуляторных процессов – цитокины/хемокины, колониестимулирующие и факторы роста, вырабатываемые как клетками опухоли, так и ее микроокружения [6]. Перестройка цитокиновой сети МкО связана с развитием эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), автономной цитокиновой сети, сопровождающей прогрессию опухолевого роста и активацией метастатического процесса [7]. Для оценки эффективности иммунотерапии показано прогностическое значение таких цитокинов, как TNFa (фактор некроза опухоли-альфа), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста), IL-6 (интерлейкин 6), IL-8 (интерлейкин 8) и IL-10 (интерлейкин 10) и др. [8].

В настоящее время имеются данные о следующих биомаркерах, влияющих на успех иммунотерапии рака:

• опухолевая мутационная нагрузка;
• общий иммунный статус пациента;
• наличие инфильтратов Т-лимфоцитов;
• экспрессия опухолевого PD-L1;
• чувствительность опухолевых клеток к уничтожению Т-клеток (включая экспрессию MHC (major histocompatibility complex), функциональный путь рецептора IFN-g);
• воспаление, опосредованное миелоидными клетками (высокий уровень С-реактивного белка и IL-6);
• высокий уровень лактатдегидрогеназы в сыворотке (что отражает как опухолевую нагрузку, так и анаэробный гликолиз) [9-11].

Диагностическое значение иммунорегуляторных медиаторов в периферической крови в качестве прогностических биомаркеров иммунотерапии у больных ПКР подтверждено лишь небольшим числом исследований [12]. Это ограничивает дальнейшее развитие эффективных стратегий лечения больных ПКР. Необходимы дополнительные исследования по поиску молекулярных маркеров при ПКР. Цель исследования – установить диагностическое значение изменений уровня медиаторов опухолевого микроокружения в сыворотке крови у больных ПКР в зависимости от стадии заболевания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включено 66 больных ПКР, проходивших обследование и лечение в отделении онкоурологии НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии ФГБОУ ВО «Саратовского ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России. Общая характеристика больных с ПКР представлена в таблице 1. Все обследованные больные были разделены на две группы в соответствии со стадиями TNM. В первую группу вошли пациенты с 1- 2 стадиями заболевания и один больной с синхронным ПКР (38 пациентов), во вторую – с 3-4 стадиями (28 пациентов). Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц (мужчин – 16, женщин – 14, средний возраст – 56,6 лет). Исследуемые группы больных были сопоставимы по полу и возрасту.

Таблица 1. Характеристика больных ПКР
Table 1. Characteristics of patients with RCC

Всем включенным в исследование больным ПКР проведено комплексное обследование согласно клиническим рекомендациям по диагностике и лечению больных раком почек [13]. Морфологическое исследование полученного материала (после проведенного оперативного лечения) проводилось по стандартной технологии. При обзорном морфологическом анализе срезы толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, использовали для определения гистологического типа опухоли, степени дифференцировки, выраженности вторичных изменений и распространенности опухолевого процесса по классификацию ВОЗ [14].

Исходя из комплекса результатов обследования, отобраны пациенты, соответствующие следующим критериям включения:

• больные ПКР без подтвержденных метастазов и с метастазами со стадией заболеванияT1a-bN0M0, T2abN0M0, T3a-bN0-1M0, Т1-4N0M1;
• гистологический тип опухоли – светлоклеточный почечно-клеточный рак;
• отсутствие предшествующего и сопутствующего специального лечения (иммунотерапия или таргетная терапия).

Дополнительно до оперативного вмешательства пациентам основной и контрольной групп проведено определение в сыворотке крови уровня медиаторов, вырабатываемых клетками МкО, методом твердофазного иммуноферментного анализа. Перечень исследуемых параметров представлен в таблице 2.

Таблица 2. Медиаторы МкО сыворотки крови
Table 2. Mediators of blood serum tumor microenvironment

Для определения уровня в сыворотке крови TNFα, INFγ, МСР-1, VEGF использовали коммерческие наборы реагентов (АО «Вектор Бест», Новосибирск), TGF-β1, G-CSF, GM-CSF – моно- и поликлональные антитела к этим медиаторам (R&DSystems, Великобритания) и трехстадийный «сэндвич» – вариант иммуноферментный анализ (ИФА). Образцы сывороток, содержащих латентную форму TGF-β1, до начала исследования активировали (при инкубации 60 мин в среде с pH 1,0-2,0 и дальнейшей нейтрализацией до pH 7,2–7,6).

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическая обработка данных выполнена с использованием пакетов прикладных программ Statistica 10 и SAS JMP 11. Для оценки изменения уровня медиаторов в сыворотке крови применяли методы описательной статистики с расчетом уровня достоверности различия между группами обследованных по критерию Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса. Чувствительность и специфичность медиаторов МкО определяли с помощью ROC-анализа с расчетом AUC (Area under ROC curve – площади под кривой). Значимым считали значение площади под ROC-кривой, превышающее 0,70. Критический уровень значимости pvalue для всех используемых процедур принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты исследования медиаторов опухолевого микроокружения были изучены для двух группа больных ПКР и представлены в таблицах 3 и 4. Как видно у больных ПКР уже на 1 и 2 стадиях заболевания имеет место нарастание в сыворотке крови уровня цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов за исключением содержания INFγ (табл. 3) по сравнению с группой условно здоровых. Уровень INFγ незначительно снижается у пациентов на 1-2 стадиях заболевания. Повышение уровня провоспалительных цитокинов, колониестимулирующих и факторов роста в сыворотке крови можно считать ассоциированным с опухолевым ростом воспалительным процессом на фоне сохраненной иммунной защиты МкО. У больных ПКР с 3 и 4 стадиями ПКР заболевание сопровождается статистически значимыми сохранением высокого уровня в сыворотке крови цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов, снижением уровня INFγ и дальнейшим подъемом концентрации факторов роста, подтверждающих прогрессию и диссеминацию опухолевого процесса. Уровни TGF-β1и VEGF у больных ПКР с 3-4 стадией заболевания превышали их содержание в группе сравнения и в группах пациентов с опухолевым ростом в пределах органа.

То есть, паракринный выход в кровоток многочисленных биоактивных молекул (цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов) или создание индуцированного злокачественными клетками профиля медиаторов воспаления вызывает экспрессию факторов роста.

Для подтверждения диагностического значения медиаторов изменения МкО в периферическом кровотоке построены ROC-кривые и посчитаны площади под ними (табл. 4). Величина площади под кривой для практически всех медиаторов, и факторов воспаления, и факторов роста по экспертной шкале достигала хорошего качества прогностической модели прежде всего в группе пациентов с 1-2 стадиями с ПКР. Точки разделения больных с 1-2 стадиями заболевания (для G-CSF69,3 пг/мл, GМ-CSF- 7,8 пг/мл, TNFα-3,9пг/мл, INFγ17,5 пг/мл, МСР-1- 332 пг/мл, VEGF- 408,3 пг/мл, TGF-β1- 49 550пг/мл) практически для каждого из иммунорегуляторных медиаторов, характеризовали эти стадии с чувствительностью 100 до 60% и эффективностью от 87,3 до 66,4%. То есть результаты исследования медиаторов еще раз показали, что генетические изменения опухолевых клеток (утрата опухолевого супрессора VHL) определяет особенности МкО, превращая в опухоль с высоким уровнем инфильтрации Т-клетками [15, 16]. В группах пациентов с 3 и 4 стадиями ПКР наибольшие площади под кривой показали факторы роста – 94,4 до 100%. Точкой разделения для VEGF стала концентрация 404,2 – 527,2 пг/мл, с чувствительностью 100-82,5% и эффективностью 92,3 – 71,3%, для TGF-β1- 49 550 – 58 500 пг/мл, с чувствительностью 94,4% и эффективностью 79,6 – 89,1%.

Таблица 3. Уровень иммунонорегуляторных медиаторов в сыворотке крови у больных ПКР до оперативного вмешательства
Table 3. The level of immunoregulatory mediators in the blood serum of patients with RCC before surgery

Таблица 4. Влияние стадии ПКР до оперативного вмешательства на уровень иммунорегуляторных медиаторов в сыворотке крови
Table 4. The effect of the RCC stage before surgery on the diagnostic level of immunoregulatory mediators in the blood serum

ОБСУЖДЕНИЕ

Выявленное нарастание в сыворотке крови содержания цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов за исключением INFγ уже на 1-2 стадиях ПКР или в периоде разрастания опухолевых клеток в пределах органа можно считать следствием начального этапа взаимодействия генетически измененных раковых и иммунных клеток МкО. Паракринная секреция многочисленных биоактивных молекул клетками МкО формирует нарастание провоспалительных цитокинов/хемокинов в сыворотке крови. Совершенно очевидно, что подъем уровня медиаторов воспаления в периферическом кровотоке приводит к изменению активности противоопухолевого иммунного ответа. Он создает среду для экстравазации и метастазирования злокачественных клеток. То есть мутационные изменения гена Фон Хиппель-Линдау (VHL) или потеря опухолевого супрессора VHL у больных ПКР с одной стороны приводит в движение гипоксический путь, усиливающий ангиогенез и гиперваскуляризацию опухолевой ткани, с другой – превращает опухолевую ткань в «горячую» или иммуно-инфильтрированную опухоль с высокими содержанием ТАМ и инфильтрацией Тклетками [17-19]. Это приводит к вышеописанному нарастанию в периферическом кровотоке содержания цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов уже на 1-2 стадиях ПКР.

Такая перестройка цитокиновой сети МкО у больных ПКР сопровождает развитие ЭМП, появление автономной цитокиновой сети, прогрессией опухолевого роста и метастазированием [20]. У больных с 3-4 стадиями ПКР перестройка системы иммунной защиты, повидимому, вследствие как роста самой опухолевой ткани, так и числа ТАМ, сопровождается нарастанием содержание факторов роста, TGF-β1 и VEGF в сыворотке крови [21]. Установленные особенности изменения в периферическом кровотоке содержания медиаторов иммунорегуляторных процессов представляют дополнительную информацию активности опухолевого роста и характеризуют нарушение состояния иммунной системы МкО. Медиаторы МкО (TNF-α, МСР-1, G-CSF, VEGF, TGF-β1) сыворотки крови обладают оптимальным соотношением чувствительности и специфичности при у больных ПКР, что позволяет получить дополнительную информацию об активности неопластического процесса.

ВЫВОДЫ

1. Рост опухолевых клеток на начальных стадиях ПКР сопровождается значимым увеличением уровня провоспалительных цитокинов/хемокинов и колониестимулирующих факторов в сыворотке крови. При прогрессировании опухолевого роста у больных ПКР имеет место активация выброса в кровоток таких факторов роста как TGF-β1 и VEGF.

2. Попадающие в периферический кровоток медиаторы МкО (цитокины/хемокины, колониестимулирующие и факторы роста) относятся к прогностическим показателям для оценки эффективности иммунотерапевтических технологий лечения опухолевых заболеваний.

ЛИТЕРАТУРА

1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCA, N estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2018;68(6):394–424; https://doi.org/10.3322/caac.21492.

2. Алексеев Б.Я., Калпинский А.С., Мухомедьярова А.А., Нюшко К.М., Каприн А.Д. Таргетная терапия больных метастатическим раком почки неблагоприятного прогноза. Онкоурология 2017;13(2):49-55; https://doi.org/10.17650/1726-9776-2017-13-2-49-55. [Alekseyev B.Ya., Kalpinskiy A.S., Mukhomediarova A.A., Nyushko K.M., Kaprin A.D. Targeted therapy in patients with poor-prognosis renal cell carcinoma. Оnkourologiya 2017;13(2):49-55. https://doi.org/10.17650/1726-9776-2017-13-2-49-55. (in Russian)].

3. Heng DY, Xie W, Regan MM, Warren MA, Golshayan AR, Sahi C, et al. Prognostic factors for overall survival in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with vascular endothelial growth factor-targeted agents: results from a large, multicenter study. J Clin Oncol 2009;27(34):5794-9. https://doi.org/10.1200/JCO.2008.21.4809.

4. Heng DY, Xie W, Regan MM, Harshman LC, Bjarnason GA, Vaishampayan UN, et al. External validation and comparison with other models of the International Metastatic RenalCell Carcinoma Database Consortium prognostic model: a population-based study. Lancet Oncol 2013;14(2):141-8; https://doi.org/10.1016/S1470-2045(12)70559-4.

5. Nixon AB, Schalper KA, Jacobs I, Potluri S, Wang IM, Fleener C. Peripheral immune-based biomarkers in cancer immunotherapy: can we realize their predictive potential? J Immunother Cancer 2019 Nov 27;7(1):325; https://doi.org/10.1186/s40425-019-0799-2.

6. Smith HO, Stephens ND, Qualls CR, Fligelman T, Wang T, Lin CY, et al. The clinical significance of inflammatory cytokines in primary cell culture in endometrial carcinoma. Mol Oncol 2013;7(1)1-54; https://doi.org/10.1016/j.molonc.2012.07.002.

7. Kuwada K, Kagawa S, Yoshida R, Sakamoto S, Ito A, Watanabe M, et al. The epithelial-to-mesenchymal transition induced by tumor-associated macrophages confers chemoresistance in peritoneally disseminated pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res 2018;37(1):307; https://doi.org/10.1186/s13046-018-0981-2.

8. Sanmamed MF, Perez-Gracia JL, Schalper KA, Fusco JP, Gonzalez A, Rodriguez-Ruiz ME, et al. Changes in serum interleukin-8 (IL-8) levels reflect and predict response to anti-PD-1 treatment in melanoma and non-small-cell lung cancer patients. Ann Oncol 2017;28(8):1988-1995; https://doi.org/10.1093/annonc/mdx190.

9. Dalgliesh GL, Furge K, Greenman C, Chen L, Bignell G, Butler A, et al. Systematic sequencing of renal carcinoma reveals inactivation of histone modifying genes. Nature 2010(463):360–3. https://doi.org/10.1038/nature08672.

10. Montironi R, Santoni M, Cheng L, Lopez-Beltran A, Massari F, Matrana MR, et al. An overview of emerging immunotargets of genitourinary tumors. Curr Drug Targets 2016(17):750–6. https://doi.org/10.2174/1389450117666151209144649.

11. Slovin SF. The need for immune biomarkers for treatment prognosis and response in genitourinary malignancies. Biomark Med 2017(11):1149–59; https://doi.org/10.2217/bmm-2017-0138.

12. Lopez-Beltran A, Henriques V, Cimadamore A, Santoni M, Cheng L, Gevaert T, et al. The Identification of Immunological Biomarkers in Kidney Cancers. Front. Oncol 2018(8):456; https://doi.org/10.3389/fonc.2018.00456.

13.Алексеев Б.Я., Волкова М.И., Калпинский А.С., Каприн А.Д., Матвеев В.Б. Клинические рекомендации по диагностике и лечению рака почки. М., 2014; 38 c. URL: http://www.oncology.ru/association/clinical-guidelines/2013/renal-cell-c.... [Alekseev B.Ya., Volkova M.I., Kalpinsky A.S., Kaprin A.D., Matveev V.B. Clinical recommendations for the diagnosis and treatment of kidney cancer. Moscow, 2014; 38 p. URL: http://www.oncology.ru/association/clinical-guidelines/2013/renal-cell-c.... (in Russian)].

14. Travis WD, Brambilla E, Müller Hermelink HK, Harris CC. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of Lung, Pleura, Thymus and Heart. IARC Press: Lyon 2004; 344 p.

15. Santoni M, Massari F, Di Nunno V, Conti A, Cimadamore A, Scarpelli M, et al. Immunotherapy in renal cell carcinoma: latest evidence and clinical implications. Drugs Context 2018(7):212528; https://doi.org/10.7573/dic.212528

16. Hah YS, Koo KC. Immunology and immunotherapeutic approaches for advanced renal cell carcinoma: a comprehensive review. Int J Mol Sci 2021;22(9):4452; https://doi.org/10.3390/ijms22094452

17. Wang Z, Liu Y, Zhang Y, Shang Y, Gao Q. MDSC-decreasing chemotherapy increases the efficacy of cytokine-induced killer cell immunotherapy in metastatic renal cell carcinoma and pancreatic cancer. Oncotarget 2016;7(4):4760-9; https://doi.org/10.18632/oncotarget.6734.

18. Захарова Н.Б., Понукалин А.Н., Комягина Ю.М., Королев А.Ю., Никольский Ю.Г. Показатель прогрессии злокачественного роста у больных с опухолевыми заболеваниями предстательной железы, мочевого пузыря, почек. Экспериментальная и клиническая урология 2019(3):72-78. https://doi.org/10.29188/2222-8543-2019-11-3-72-78. [Zakharova N.B., Ponukalin A.N., Komyagina Yu.M., Korolev A.Yu., Nikolskiy Yu.G. The indicator of the progression of malignant growth in patients with neoplastic diseases of the prostate, bladder, and kidneys. Eksperimentalnaya i klinicheskaya urologiya = Experimental and Clinical Urology 2019(3):72-78; https://doi.org/10.29188/2222-8543-2019-11-3-72-78. (in Russian)].

19. Komohara Y, Hasita H, Ohnishi K, Fujiwara Y, Suzu S, Eto M, Takeya M.. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci 2011;102(7):1424-31. https://doi.org/10.1111/j.1349-7006.2011.01945.x

20. Yin Q, Hung SC,. Rathmell WK, Shen L, Wang L, Lin W, et al. Integrative radiomics expression predicts molecular subtypes of primary clear cell renal cell carcinoma. Clin Radiol 2018;73(9):782–791. https://doi.org/10.1016/j.crad.2018.04.009

21. Алексеева Г.Н., Гурина Л.И., Писарева Л.Ф., Волков М.В., Чердынцева Н.В. Персонализированный подход к лечению метастатического рака почки. Тихоокеанский медицинский журнал 2020;(4):63-67; https://doi.org/10.34215/1609-1175-2020-4-63-67 [Alekseeva G.N., Gurina L.I., Pisareva L.F., Volkov M.V., Cherdy`nceva N.V. Personalized approach to the treatment of metastatic kidney cancer. Tixookeanskij medicinskij zhurnal = Pacific Medical Journal 2020(4):63-67. https://doi.org/10.34215/1609-1175-2020-4-63-67. (in Russian)].