ВВЕДЕНИЕ

Стандартное спермиологическое исследование, выполняемое согласно руководству ВОЗ, остается на сегодняшний день основным методом оценки мужской фертильности [1]. Вместе с тем, данный метод исследования имеет ряд существенных ограничений, в том числе низкую прогностическую ценность в отношении результатов программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и исходов беременности, достигнутой естественным путем [2].

Ограничения стандартного спермиологического исследования диктуют необходимость использования дополнительных методов оценки мужской фертильности. В качестве наиболее перспективного и широко используемого теста выступает оценка уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. Результаты недавних исследований демонстрируют связь уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с нарушением развития эмбрионов в программах ВРТ, вероятностью наступления беременности в программах ВРТ и при естественном зачатии, а также с невынашиванием беременности [2-8].

Вопрос широкого внедрения исследования фрагментации ДНК сперматозоидов в клиническую практику и определение показаний к данному исследованию по-прежнему обсуждается. Важным фактором, ограничивающим его использование, является отсутствие стандартизации существующих методов оценки фрагментации ДНК [9]. Дополнительным фактором, ограничивающим широкое внедрение исследования фрагментации ДНК сперматозоидов (ФДС) в диагностику мужского бесплодия, является стоимость. По сравнению с другими тестами на фертильность мужчин, тест на фрагментацию ДНК является дорогостоящим, при этом расходы, как правило, ложатся на пациента. В связи с этим активно изучается корреляция между уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов и стандартными параметрами спермы, что потенциально может позволить отбирать пациентов, которым выполнять исследование фрагментации ДНК сперматозоидов нецелесообразно.

Целью настоящего исследования явилось изучение связи уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с показателями стандартного спермиологического исследования и возрастом мужчин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужили результаты обследования 121 мужчины в возрасте от 21 года до 53 лет (средний возраст 32,7±4,5 года), прошедших обследование в клинике «Мать и Дитя Ярославль» в период с января 2019 по апрель 2020 года. Исследование носило ретроспективный характер, в связи с чем, фертильный статус мужчин не уточнялся. Критериями исключения для настоящего исследования были тяжелые формы олигозооспермии (концентрация сперматозоидов менее 1 млн/мл) и азооспермия.

Спермиологическое исследование

Образцы спермы были собраны в специально отведенном для этого помещении нашей лаборатории с помощью аудиовизуальной стимуляции после 2-5 дней сексуального воздержания. Стандартное спермиологическое исследование выполнялось согласно последнему изданию Руководства ВОЗ [1].

Исследование уровня фрагментации ДНК сперматозоидов

Повреждение ДНК сперматозоидов оценивали с помощью анализа TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) на основе проточной цитометрии и сообщали % фрагментации ДНК сперматозоидов, отражая процент сперматозоидов с поврежденной ДНК.

Статистическая обработка

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS 11.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). С целью выявления взаимосвязи уровня фрагментации ДНК сперматозоидов и стандартных параметров спермы, а также возраста мужчин, был применен метод корреляционного анализа с расчетом коэффициента параметрической корреляции Пирсона. Критерием статистической значимости корреляции считали p<0,05. Для интерпретации зависимости силы между параметрами исследования предполагались следующие уровни корреляции: <0,2 – отсутствие связи, 0,2– 0,4 – слабая связь, 0,4–0,7 – умеренная связь, > 0,7- сильная связь. Критерий Манна-Уитни использовали для оценки значимости различий непараметрических непрерывных переменных, таких как параметры спермы. Результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у 121 мужчины продемонстрировало значения в интервале от 1% до 45,7%, средний показатель 11,4± 7,8%. У 30 пациентов уровень фрагментации ДНК был более 15% (среднее значение 22,0±7,2%), а у 91 пациента уровень фрагментации ДНК был менее 15% (среднее значение 7,9±3,9%). В таблице 1 представлены средние значения параметров стандартного спермиологического исследования в общей выборке и в подгруппах с уровнем ФДС <15% и ФДС ≥15%.

Таблица 1. Результаты стандартного спермиологического исследования
Table 1. Results of a standard sperm examination

Сравнительный анализ групп пациентов с ФДС <15% (n =91) и ФДС ≥15% (n = 30) не выявил достоверных различий по таким параметрам как возраст пациента, объем эякулята, концентрация сперматозоидов, общая подвижность, доля морфологически нормальных форм, процент аномалий головки в структуре морфологических дефектов и концентрация лейкоцитов спермы. Достоверные отличия между группами наблюдались только по параметру прогрессивной подвижности и общей подвижности. Среднее значение доли прогрессивно подвижных форм сперматозоидов было значимо выше в группе пациентов ФДС <15% (55,07±18,1%) по сравнению с группой пациентов с ФДС ≥15% (46,2±19,8%).

Результаты корреляционного анализа (табл. 2) выявили слабую отрицательную связь между уровнем ФДС и долей прогрессивно-подвижных форм – r = -0,26 (p<0,01). Корреляция ФДС с другими параметрами спермы (объем, концентрация, общая подвижность, нормальная морфология, дефекты головки, концентрация лейкоцитов) и возрастом пациентов признана очень слабой и статистически незначимой.

Таблица 2.Корреляции Пирсона уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с возрастом и параметрами стандартного спермиологического исследования
Table 2. Pearson correlations of the level of sperm DNA fragmentation with age and parameters of standard sperm examination

Дополнительно выполнено парное сравнение частоты встречаемости повышенной ФДС (>15%) в группах нормальный объем спермы/олигоспермия, нормальная концентрация сперматозоидов/олигозооспермия, нормальная морфология/тератозооспермия, нормальная прогрессивная подвижность сперматозоидов /астенозооспермия (табл. 3).

Таблица 3. Частота встречаемости нормальной и повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов в подгруппах нормальное значение параметров спермы/отклонение от нормы
Table 3. Frequency of occurrence of normal and increased sperm DNA fragmentation in subgroups of normal sperm parameter / deviation from the norm

Результаты анализа продемонстрировали, что повышенная ФДС в 1,8 раз чаще встречается среди пациентов с астенозооспермией (21,4%) по сравнению с пациентами с нормальной подвижностью сперматозоидов (11,8%) (p <0,05). Сравнительный анализ в группах нормальная морфология сперматозоидов/тератозооспермия и нормальное количество сперматозоидов/олигозооспермия, нормальный объем спермы/олигоспермия не выявил достоверных различий.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенного нами ретроспективного исследования продемонстрировали связь между прогрессивной подвижностью и уровнем ФДС при отсутствии взаимосвязи между уровнем ФДС и возрастом, а также другими параметрами спермы (морфология, общее количество сперматозоидов). Выявленная корреляция между долей прогрессивно-подвижных форм и уровнем ФДС характеризуется как слабая (r = -0,26), при этом повышенный уровень ФДС (≥15%) в 1,8 раза чаще встречается среди пациентов с астенозооспермией по сравнению с пациентами с нормальной подвижностью сперматозоидов.

Причина взаимосвязи уровня ФДС и прогрессивной подвижности сперматозоидов не совсем ясна. Вероятно, это связано с тем, что упаковка хроматина (замена гистонов на протамины в ядре сперматозоида) и развитие жгутика сперматозоида происходят на одном и том же этапе сперматогенеза – спермиогенезе [10]. Экспериментальные исследования на животных моделях, в которых процесс упаковки хроматина искусственно нарушался за счет снижения экспрессии протамина или переходных белков, продемонстрировали связь нарушенной упаковки хроматина с уровнем аномалий жгутика и низкой подвижностью сперматозоидов [11, 12]. Так же предполагается роль оксидативного стресса, так как избыток активных форм кислорода может приводить к перекисному окислению липидов мембраны сперматозоидов и нарушению подвижности, а транслокация перекисей липидов в ядро может привести к повреждению ДНК сперматозоида [13, 14].

На сегодняшний день, связь между уровнем ФДС и параметрами стандартного спермиологического исследования остается противоречивой. В таблице 4 представлены результаты исследований, изучающих связь ФДС с результатами стандартного спермиологического исследования.

Таблица 4. Результаты исследований, изучавших связь фрагментации ДНК сперматозоидов с результатами стандартного спермиологического исследования
Table 4. Results of studies investigating the relationship of sperm DNA fragmentation with the results of standard sperm examination

Примечание. Достоверность выявленной корреляции: NS – статистически недостоверна, *p <0,05, ** p <0,001; ○ – корреляция c % нежизнеспособных форм; ^a – корреляция с долей морфологически аномальных форм
Note. Significance of the revealed correlation: NS - statistically insignificant, * p <0,05, ** p <0,001; ○ – correlation with% of non-viable forms; ^a - correlation with the proportion of morphologically abnormal forms

Ни одно из представленных исследований не выявило взаимосвязи между объемом эякулята и уровнем ФДС. Слабая отрицательная корреляция между концентрацией сперматозоидов и уровнем ФДС выявлена в двух из 11 представленных исследований [15, 16]. Значимая отрицательная корреляция доли прогрессивно подвижных сперматозоидов с уровнем ФДС отмечена в 6 исследованиях, при этом уровень связи варьировал от слабой до умеренной [17-20, 21]. Умеренная отрицательная связь доли морфологически нормальных форм и уровня ФДС наблюдалась в 4 исследованиях, в одном исследовании имела место слабая отрицательная корреляция, а в 5 исследованиях связи между морфологией сперматозоидов и уровнем ФДС не выявлено [10, 15, 20, 22-24]. В одном из представленных исследований продемонстрирована слабая положительная корреляция уровня ФДС с долей аномалий головки в структуре морфологических дефектов [22], в то время как результаты проведенного нами исследования не выявили связи между этими параметрами.

Особого внимания заслуживает исследование P.J. Stahl и соавт., где одни и те же пробы спермы исследовались с использованием сразу двух методов оценки ФДС: SCSA (Sperm chromatin structure assay) и TUNEL [16]. Изучение корреляция уровня ФДС и стандартных параметров спермы показало разные результаты для каждого из методов. Результаты SCSA демонстрировали достоверную умеренную корреляцию с концентрацией сперматозоидов и общей подвижностью сперматозоидов, в то время как результаты TUNEL коррелировали только с общей подвижностью сперматозоидов, и корреляция была очень слабой (табл. 4). Результаты данного исследования ставят под сомнение возможность сравнения результатов исследований, использующих разные методы оценки уровня ФДС.

В определенной степени использование различных методов оценки ФДС могло бы объяснить противоречивые данные исследований, оценивающих корреляцию уровня ФДС и параметров стандартного спермиологического исследования. Прямые (TUNEL) и непрямые (SCD (Sperm Chromatin Dispersion), SCSA) методы оценки ФДС имеют концептуальное различие. Непрямые методы, являются мерой «потенциального» повреждения ДНК сперматозоидов, в отличие от прямых методов, выявляющих «реальное» повреждение ДНК сперматозоидов [25]. Сопоставление результатов методов противоречивы. В рассмотренном ранее исследовании P.J. Stahl и соавт. результаты SCSA слабо коррелировали с результатами TUNEL (г= 0,31, p <00001), а вероятность того, что результаты анализа, выполненного одним методом, продемонстрируют нормальные значения, а при исследовании другим методом выявят повышенную ФДС – высокая (41%) [16]. В то же время ряд других исследований, со значительно меньшим объемом выборки, демонстрирует противоположный результат – высокую корреляцию результатов SCSA и TUNEL (коэффициент корреляции от 0,71 до 0,99) [25-27].

При этом, если мы обратимся к 3 исследованиям, использующим для оценки ФДС метод TUNEL, который применен в настоящем исследовании, то увидим, что их результаты так же не сопоставимы [16, 17, 23].

В наиболее крупном из представленных исследовании S. Belloc и соавт. изучалась корреляция уровня ФДС и стандартных параметров спермы у 1084 мужчин с изолированными формами патозооспермии (астенозооспермия, тератозооспермия, олигозооспермия). Корреляция отмечена только между уровнем ФДС и прогрессивной подвижностью сперматозоидов в группах с изолированной астено- и тератозооспермией. Кроме этого, высокий уровень ФДС (> 30%) достоверно чаще (p <0,00001) наблюдался у мужчин с астенозоооспермией (31%) по сравнению с пациентами с олигозооспермией (18%) и тератозооспермией (19%) [17]. Интересные данные получены в другом исследовании, где оценивалась связь между уровнем ФДС и жизнеспособностью сперматозоидов. Исходная выборка состояла из 50 пациентов с некрозооспермией и 20 пациентов с нормальным уровнем жизнеспособных сперматозоидов, что безусловно не позволяет экстраполировать результаты полученного исследования на мужскую популяцию в целом. Результаты исследования продемонстрировали сильную положительную связь доли нежизнеспособных сперматозоидов с уровнем ФДС (r = 0,878; p = 0,001). Кроме того, была выявлена статистически значимая отрицательная корреляция между уровнем ФДС и подвижностью сперматозоидов (r = – 0,646; р = 0,001), а также положительная корреляция ФДС с долей морфологически аномальных сперматозоидов (r = 0,434; р = 0,001) [23].

Определенный вклад в высокую вариабельность результатов исследований с использованием одного и того же метода оценки ФДС вносит отсутствие методологической стандартизации методов оценки ФДС [28]. Из трех исследований, использующих для оценки ФДС метод TUNEL, только в одном применяли проточную цитометрию [17], два других исследования использовали флюоресцентную микроскопию [16,23] для идентификации разрывов ДНК.

В нашем исследовании не выявлено взаимосвязи уровня ФДС с возрастом мужчин, в то время как большинство исследований демонстрирует повышение уровня ФДС с увеличением возраста [29,30]. Полученные результаты, вероятно, связаны с неоднородной возрастной структурой выборки – возраст 74% мужчин, находился в диапазоне от 30-40 лет, 14% в интервале от 20 до 30 лет, 9% в возрасте от 40 до 50 лет и лишь у 3% был возрасте старше 50 лет. Существенным ограничением нашего исследования является то, что мы не выявляли факторы образа жизни (курение, потребление алкоголя, тепловые процедуры) и сопутствующую патологию (варикоцеле, ожирение), которые потенциально могли повлиять на уровень ФДС и исказить результаты корреляционного анализа.

ВЫВОДЫ

Результаты нашего исследования демонстрируют взаимосвязь между уровнем ФДС и долей прогрессивно-подвижных форм сперматозоидов. Тем не менее, слабый характер выявленной взаимосвязи диктует необходимость рассматривать исследование ФДС как самостоятельный тест в оценке мужской фертильности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Organization WH, Cooper TG. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Book WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen; Editor, 2010.
2. Guzick DS, Overstreet JW, Factor-Litvak P, Brazil CK, Nakajima S. T., Coutifaris C, et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. N Engl J Med 2001; 345(19):1388-93. https://doi.org/10.1056/NEJMoa003005.
3. Tan J, Taskin O, Albert A, Bedaiwy MA. Association between sperm DNA fragmentation and idiopathic recurrent pregnancy loss: a systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online 2019;38(6):951-960. https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2018.12.029.
4. The clinical utility of sperm DNA integrity testing: a guideline. Fertil Steril 2013;99(3):673-7.
5. Spanò M, Bonde JP, Hjøllund HI, Kolstad HA, Cordelli E, Leter G. Sperm chromatin damage impairs human fertility. The Danish First Pregnancy Planner Study Team. Fertil Steril 2000;73(1):43-50. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(99)00462-8.
6. Evenson DP, Jost LK, Marshall D, Zinaman MJ, Clegg E, Purvis K, et al. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum Reprod 1999;14(4):1039-49. https://doi.org/10.1093/humrep/14.4.1039.
7. Robinson L, Gallos ID, Conner SJ, Rajkhowa M, Miller D, Lewis S, et al. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and metaanalysis. Hum Reprod 2012;27(10):2908-17. https://doi.org/10.1093/humrep/des261.
8. Zini A, Boman JM, Belzile E, Ciampi A. Sperm DNA damage is associated with an increased risk of pregnancy loss after IVF and ICSI: systematic review and meta-analysis. Hum Reprod 2008;23(12):2663-8. https://doi.org/10.1093/humrep/den321.
9. Simon L, Emery B, Carrell DT. Sperm DNA Fragmentation: Consequences for Reproduction. Adv Exp Med Biol 2019; 1166:87-105. https://doi.org/10.1007/978-3-030-21664-1_6.
10. Hasanzadeh Keshteli S, Farsi MM, Khafri S. Should We Perform Semen Analysis, DNA Fragmentation and Hypo-osmotic Swelling Tests together? Int J Mol Cell Med 2016;5(4):246–254.
11. Cho C, Willis WD, Goulding EH, Jung-Ha H, Choi YC, Hecht NB, et al. Haploinsufficiency of protamine-1 or -2 causes infertility in mice. Nat Genet 2001;28(1):82-6.
12. Yu YE, Zhang Y, Unni E, Shirley CR, Deng JM, Russell LD, et al. Abnormal spermatogenesis and reduced fertility in transition nuclear protein 1-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97(9):4683-8. https://doi.org/10.1073/pnas.97.9.4683.
13.  Lewis SE, Aitken RJ. DNA damage to spermatozoa has impacts on fertilization and pregnancy. Cell Tissue Res 2005 Oct;322(1):33-41. https://doi.org/10.1007/s00441-005-1097-5.
14.  Muratori M, Piomboni P, Baldi E, Filimberti E, Pecchioli P, Moretti E, et al. unctional and ultrastructural features of DNA-fragmented human sperm. J Androl 2000; 21(6):903-12.
15.  Gill K, Jakubik J, Rosiak-Gill A, Kups M, Lukaszuk M, Kurpisz M, et al. Utility and Predictive Value of Human Standard Semen Parameters and Sperm DNA Dispersion for Fertility Potential. Int J Environ Res Public Health 2019;16(11):2004. https://doi.org/10.3390/ijerph16112004
16. Stahl PJ, Cogan C, Mehta A, Bolyakov A, Paduch DA, Goldstein M. Concordance among sperm deoxyribonucleic acid integrity assays and semen parameters. Fertility and Sterility 2015; 104(1):56-61.
17. Belloc S, Benkhalifa M, Cohen-Bacrie M, Dalleac A, Chahine H, Amar E, et al. Which isolated sperm abnormality is most related to sperm DNA damage in men presenting for infertility evaluation. J Assist Reprod Genet 2014;31(5):527–532. https://doi.org/10.1007/s10815-014-0194-3.
18. Evgeni E, Lymberopoulos G, Touloupidis S, Asimakopoulos B. Sperm nuclear DNA fragmentation and its association with semen quality in Greek men. Andrologia 2015;47(10):1166-74. https://doi.org/10.1111/and.12398.
19. Al Omrani B, Al Eisa N, Javed M, Al Ghedan M, Al Matrafi H, Al Sufyan H. Associations of sperm DNA fragmentation with lifestyle factors and semen parameters of Saudi men and its impact on ICSI outcome. Reprod Biol Endocrinol 2018;16(1):49. https://doi.org/10.1186/s12958-018-0369-3.
20. Yuan M, Huang L, Leung WT, Wang M, Meng Y, Huang Z, et al. Sperm DNA fragmentation valued by SCSA and its correlation with conventional sperm parameters in male partner of recurrent spontaneous abortion couple. Biosci Trends 2019;13(2):152-159. https://doi.org/10.5582/bst.2018.01292.
21. Homa ST, Vassiliou AM, Stone J, Killeen AP, Dawkins A, Xie J, et al. A Comparison Between Two Assays for Measuring Seminal Oxidative Stress and their Relationship with Sperm DNA Fragmentation and Semen Parameters. Genes (Basel) 2019;10(3):236. https://doi.org/10.3390/genes10030236.
22. Le MT, Nguyen TA T, Nguyen H TT, Nguyen T TT, Nguyen VT, Le DD, et al. Does sperm DNA fragmentation correlate with semen parameters? Reproductive medicine and biology 2019;18(4):390-396.
23. Brahem S, Jellad S, Ibala S, Saad A, Mehdi M. DNA fragmentation status in patients with necrozoospermia. Syst Biol Reprod Med 2012;58(6):319-23. https://doi.org/10.3109/19396368.2012.710869.
24. Cho C, Willis WD, Goulding EH, Jung-Ha H, Choi Y-C, Hecht NB., et al. Haploinsufficiency of protamine-1 or -2 causes infertility in mice. Nature Genetics 2001;28(1):82-86.
25. Henkel R, Hoogendijk CF, Bouic PJ, Kruger TF. TUNEL assay and SCSA determine different aspects of sperm DNA damage. Andrologia 2010;42(5):305-13. https://doi.org/10.1111/j.1439-0272.2009.01002.x.
26. Chohan KR, Griffin JT, Lafromboise M, De Jonge CJ, Carrell DT. Comparison of Chromatin Assays for DNA Fragmentation Evaluation in Human Sperm. J Androl 2006;27(1):53-9. https://doi.org/10.2164/jandrol.05068.
27. Zini A, Bielecki R, Phang D, Zenzes MT. Correlations between two markers of sperm DNA integrity, DNA denaturation and DNA fragmentation, in fertile and infertile men. Fertil Steril 2001;75(4):674-7. https://doi.org/10.1016/ s0015-0282(00)01796-9.
28. Chi HJ, Chung DY, Choi SY, Kim JH, Kim GY, Lee JS, et al. Integrity of human sperm DNA assessed by the neutral comet assay and its relationship to semen parameters and clinical outcomes for the IVF-ET program. Clin Exp Reprod Med 2011;38(1):10-7. https://doi.org/10.5653/cerm.2011.38.1.10.
29. Johnson SL, Dunleavy J, Gemmell NJ, Nakagawa S. Consistent age-dependent declines in human semen quality: a systematic review and meta-analysis. Ageing Res Rev 2015;19:22-33. https://doi.org/10.1016/j.arr.2014.10.007.
30. Paoli D, Pecora G, Pallotti F, Faja F, Pelloni M, Lenzi A, et al. Cytological and molecular aspects of the ageing sperm. Hum Reprod 2019;34(2):218-227.
31. Samplaski MK, Dimitromanolakis A, Lo KC, Grober ED, Mullen B, Garbens A, et al. The relationship between sperm viability and DNA fragmentation rates. Reprod Biol Endocrinol 2015;13:42. https://doi.org/10.1186/s12958-015-0035-y.