ВВЕДЕНИЕ

Хронический простатит является частым и полиэтиологичным заболеванием. К числу причин простатита относят в том числе и инфекции, преимущественно бактериальные [1]. Хронический бактериальный простатит является причиной 5-10% всех случаев простатита, из которых не менее 30% связаны с рецидивирующими инфекциями мочевыводящих путей [2].

Применение молекулярно-биологических методов при анализе бактериального разнообразия (метатаксономика) секрета предстательной железы и эякулята для оценки мужской микробиоты позволило выявить его разнообразие при хроническом простатите [3, 4]. Изучение эякулята, а не секрета предстательной железы при хроническом простатите дает возможность оценить состояние не только предстательной железы, но и других органов репродуктивной системы (семенных пузырьков, эпидидимиса и др.). Для диагностики хронического бактериального простатита метод изучения эякулята обладает более высокой чувствительностью, чем экспрессия простатического секрета [5]. Кроме того, получение эякулята, а не секрета предстательной железы достаточно практично и дает возможность пациенту собрать материал в более комфортных условиях, не прибегая к помощи медицинского персонала.

С одной стороны, ряд исследователей считает присутствие бактерий в сперме обычным явлением, в том числе и у здоровых людей [6, 7]. Семенная плазма имеет специфическую микробиоту, и возможно постулировать, что присутствие специфической бактериальной среды может быть не вредным, но естественным для нормального функционирования сперматозоидов [8, 9]. С другой стороны, показано отличие бактериального состава спермы при хроническом простатите и у здоровых людей [10, 11]. При этом многие штаммы уропатогенов, выявленных при хроническом простатите, мультирезистентны и проявляют способность к образованию биопленок [12].

Бактериальные биопленки – комплексные полимикробные структуры, состоящие из бактериальных клеток, заключенных во внеклеточный полимерный матрикс, продуцируемый этими клетками [13]. Внеклеточный матрикс состоит из многих биомолекул, включает углеводы, белки и нуклеиновые кислоты. Внеклеточный матрикс биопленок выполняет скелетную функцию, поддерживая структуру биопленки и, вероятно, помогает бактериям сопротивляться антибактериальному действию. Бактерии в структуре биопленки умеют избегать эрадикации и до 1000 раз более устойчивы к антибиотикотерапии, чем их планктонные аналоги [14].

В настоящее время нет общепринятых методов лечения биопленочных инфекций [15]. Так как чувствительность к антибиотикам бактерий в составе биопленок значительно ниже, чем в планктонном состоянии, разрабатываются методы терапии, позволяющие разрушать целостность биопленок [16]. Идет интенсивная работа над синтезом и оценкой небольших молекул, разрушающих бактериальные биопленки [17–20].

Один из подходов к терапии заболеваний, связанных с биопленками – использование ферментных препаратов. Препарат бовгиалуронидаза азоксимер представляет собой пролонгированную термостабильную форму гиалуронидазы, которая обладает мукоцидным действием, разрушая гиалуроновую кислоту фиброзной ткани при воспалительных заболеваниях, сопровождающихся фиброзом [21]. Есть публикации о положительных результатах применения лонгидазы при хроническом простатите [22].

Цель исследования: изучить действие препарата бовгиалуронидаза азоксимер при хроническом простатите, которое может быть обусловлено ферментативным действием гиалуронидазы на матрикс бактериальных биопленок, что увеличивает биодоступность антибиотиков, приводя к переходу бактерий в планктонное состояние.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведено электронно-микроскопическое исследование эякулята 42 пациентов хроническим простатитом, из них 32 рандомно выбранных пациента получали комбинированное антибактериальное лечение (4-6 недель) совместно с бовгиалуронидазы азоксимером (12 недель) (группа I), 10 пациентов получали только антибактериальную терапию согласно клиническим рекомендациям (группа II).

Электронно-микроскопическое исследование эякулята проводили до начала лечения и через 3 месяца после начала терапии.

Для проведения электронно-микроскопического исследования эякулят разводили изотоническим раствором хлористого натрия в 5-8 раз, добавляли 0,1 мл фиксатора (2,5% раствор глютарового альдегида на 0,1М какодилатном буфере, рН 7,2) и центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. К осадку добавляли 2 мл фиксатора и инкубировали в течение 2-24 час при 4^оС. Осадок дофиксировали 1% раствором осмиевой кислоты, обезвоживали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заливали в эпонаралдитовую смесь. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме «UltraCut 111», окрашивали цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе «JEM 100S» при увеличении х5000 (общий просмотр) и х16000–х18000 (исследование органоидов).

На ультратонких срезах подсчитывали количество бактериальных микроколоний и нейтрофильных лейкоцитов на 100 сперматозоидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Бактериальные микроколонии были обнаружены в сперме 24 пациентов группы I и 6 пациентов группы II.

В процессе лечения 24 пациентов I группы, имеющих бактериальные микроколонии, у 12 (50%) их количество уменьшилось, а у 9 (37,5%) – не обнаруживались, у 3 (12,5%) – количество колоний не изменилось, из 6 больных II группы такие же изменения отмечены у 2 (33,3%), 1 (16,6%) и 3 (50%) больных соответственно. Снижение количества нейтрофилов отмечено у 22 (68,7%) больных I группы и 3 (30%) пациентов - II группы группы (табл. 1, 2).

Таблица1. Количество пациентов в I и II группах, имеющих бактериальные микроколонии в сперме, до и после терапии
Table 1. The number of patients in groups I and II with bacterial microcolonies in semen before and after therapy

Таблица 2. Количество пациентов I и II групп, у которых изменилось количество нейтрофильных лейкоцитов в сперме после терапии
Table 2. The number of patients of groups I and II in which the number of neutrophilic leukocytes in semen has changed

В процессе лечения у большинства пациентов группы I наблюдали количественные изменения содержания бактериальных колоний и нейтрофильных лейкоцитов (расчет на 100 сперматозоидов). Среднее количество бактериальных микроколоний до лечения было 11,4 в группе I и 10,3 – в группе II. После лечения среднее количество микроколоний было 4,1 в группе I и 6,2 – в группе II. Среднее количество нейтрофильных лейкоцитов до лечения было 14,8 в группе I и 16,0 в группе II. После лечения среднее количество нейтрофильных лейкоцитов было 4,7 в группе I и 14,2 в группе II.

Существенные изменения выявлены в морфологии бактериальных колоний. До лечения бактериальные микроколонии можно охарактеризовать как биопленки по характерным признакам: наличие гетерогенных микроорганизмов в одной микроколонии, наличие волокнистого матрикса, в который погружены бактерии.

На рис.1 представлены грамотрицательные бактерии, заключенные в волокнистый матрикс; на рис. 2 волокнистый матрикс окружает грамположительные и грамотрицательные бактерии. После терапии в группе I выявляются лежащие отдельно единичные бактерии (планктонное состояние) (рис.3), в ряде случаев обнаруживается повреждение клеточной стенки бактерий (рис. 4). В группе II также выявлены количественные изменения содержания микроколоний и нейтрофильных лейкоцитов, однако морфология микроколоний в группе II не меняется.

Рис.1. Грамотрицательные бактерии, заключенные в волокнистый матрикс, формируют биопленку в эякуляте (пациент группы I, до лечения)
Fig.1. Gram-negative bacteria, enclosed in a fibrous matrix, form a biofilm in the ejaculate (group I patient, before treatment)

Рис.2. Грамположительные и грамотрицательные бактерии, заключенные в волокнистый матрикс, формируют биопленку в эякуляте (пациент группы I, до лечения)
Fig.2. Gram-positive and gram-negative bacteria, enclosed in a fibrous matrix, form a biofilm in the ejaculate (group I patient, before treatment)

Рис.3. Грамотрицательная бактерия в планктонном состоянии. Матрикс вокруг бактриии отсутствует
Fig.3. Gram-negative bacterium in the planktonic state. There is no matrix around the bactria. Group 1 patient after treatment 

Рис.4. Грамположительные бактерии с поврежденной клеточной стенкой. Пациент группы I после лечения
Fig.4. Gram-positive bacteria with damaged cell walls. Group I patient after treatment

ОБСУЖДЕНИЕ

Для визуализации биопленок чаще всего используется сканирующая электронная микроскопия, позволяющая определять трехмерную структуру биопленки [23, 24]. Этот метод позволяет исследовать топографию и плотность биопленки на поверхности образца. Однако трансмиссионная электронная микроскопия, несмотря на сложный процесс пробоподготовки, считается золотым стандартом, позволяющим оценить внутреннюю структуру биопленки и наблюдать изменения матрикса в процессе терапии [25, 26]. Это важный момент, так как именно наличие внеклеточного полимерного матрикса в биопленках затрудняет действие противомикробных препаратов и делает бактерии устойчивыми к антибиотикам и другим лекарственным средствам [27].

Интересные результаты были получены при добавлении Лонгидазы^® к стандартной антибактериальной терапии в лечении хронического простатита. Отмечалось снижение клинического индекса хронического простатита, а также уменьшение размера очагов плотности, фиброза в тканях предстательной железы, обогащение сосудистого рисунка, повышение скорости потока крови в сосудах [28, 29]. В настоящей работе мы показали изменение количества активных нейтрофилов в эякуляте, что является показателем уменьшения выраженности воспалительного процесса. В контрольной группе (антибиотики без добавления лонгидазы) содержание нейтрофильных лейкоцитов в эякуляте практически не изменилось.

Ключевым аспектом данного исследования является оценка эффективности бовгиалуронидазы азоксимера в отношении возможности разрушения биопленок, формирующих защиту микроколоний различных бактерий в эякуляте и способствующих устойчивости микроорганизмов к антимикробной терапии. Ранее подобные эффекты Лонгидазы^® были изучены исключительно in vitro [30]. Наше исследование является первым, доказывающим этот эффект in vivo. Благодаря применению электронной микроскопии были обнаружены различия в эякуляте пациентов до и после лечения. Данные различия отмечались именно в группе пациентов, получавших бовгиалуронидазу азоксимер: продемонстрировано уменьшение количества колоний микробов, окруженных матриксом различной природы, чаще мукополисахаридной (биопленки), либо изменения морфологии самих микроколоний. Исчезновение межклеточного матрикса и переход бактерий в планктонную форму существования является показателем разрушения бактериальных биопленок. В контрольной группе подобных изменений не происходило.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение трансмиссионной электронной микроскопии при исследовании эякулята пациентов с хроническим простатитом позволяет выявить особенности структуры бактериальных биопленок в процессе терапии. В настоящей работе показали, что при комбинированной антибактериальной терапии совместно с бовгиалуронидазы азоксимером изменяется матрикс биопленок и происходит переход бактерий в планктонную форму.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ejike CE, Ezeanyika LU. Prevalence of chronic prostatitis symptoms in a randomly surveyed adult population of urban-community-dwelling Nigerian males. Int J Urol 2008;15(4):340–3. https://doi.org/10.1111/j.1442-2042.2008.02003.x.

2. Shang Y, Liu C, Cui D, Han G, Yi S. The effect of chronic bacterial prostatitis on semen quality in adult men: a meta-analysis of case-control studies. Sci Rep 2014;4(1):7233. https://doi.org/10.1038/srep07233.

3. Коган М.И., Набока Ю.Л., Исмаилов Р.С. Микробиота секрета простаты: сравнительный анализ хронического простатита категорий II и IIIA. Урология 2020;(2):16-22. https://doi.org/https://dx.doi.org/10.18565/urology.2020.2.16-22. [Kogan M.I., Naboka Y.L., Ismailov R.S. Prostatic secretion microbiota: a comparative analysis of the chronical prostatitis II and IIIa category. Urologiya = Urologiia 2020;(2):16-22. (In Russian)].

4. Suárez JP, Cardona Maya WD. Microbiota, prostatitis, and fertility: bacterial diversity as a possible health ally. Adv Urol 2021:1007366. https://doi.org/10.1155/2021/1007366.

5. Budía A, Luis Palmero J, Broseta E, Tejadillos S, Benedicto A, Queipo JA, et al. Value of semen culture in the diagnosis of chronic bacterial prostatitis: a simplified method. Scand J Urol Nephrol 2006;40(4):326–331. https://doi.org/10.1080/00365590600748247.

6. Cottell E, Harrison RF, McCaffrey M, Walsh T, Mallon E, C Barry-Kinsella. Are seminal fluid microorganisms of significance or merely contaminants? Fertil Steril 2000;74(3):465–70. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(00)00709-3

7. Rodin DM, Larone D, Goldstein M. Relationship between semen cultures, leukospermia, and semen analysis in men undergoing fertility evaluation. Fertil Steril 2003;79(Suppl 3):1555–8. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(03)00340-6.

8. Weng SL, Chiu CM, Lin FM, Huang WC, Liang C, Yang T, et al. Bacterial communities in semen from men of infertile couples: metagenomic sequencing reveals relationships of seminal microbiota to semen quality. PLoS One 2014;9:e110152. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110152.eCollection2014.

9. Mändar R, Punab M, Borovkova N, Lapp E, Kiiker R, Korrovits P, et al. Complementary seminovaginal microbiome in couples. Res Microbiol 2015;166:(5):440–7. https://doi.org/10.1016/j.resmic.2015.03.009.

10. Delcaru C, Alexandru I, Podgoreanu P, Grosu M, Stavropoulos E, Chifiriuc MC, et al. Microbial biofilms in urinary tract infections and prostatitis: etiology, pathogenicity, and combating strategies. Pathogens 2016;5(4):65. https://doi.org/10.3390/pathogens5040065.

11. Magri V, Boltri M, Cai T, Colombo R, Cuzzocrea S, De Visschere P, et al. Multidisciplinary approach to prostatitis. Arch Ital Urol Androl 2019;90(4):227-248. https://doi.org/10.4081/aiua.2018.4.227.

12. Mazzoli S. Biofilms in chronic bacterial prostatitis (NIH-II) and in prostatic calcifications. FEMS Immunol Med Microbiol 2010;59(3):337-44. https://doi.org/10.1111/j.1574695X.2010.00659.x.

13. Flemming HC, Wingender J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol 2010;8(9):623–33. https://doi.org/10.1038/nrmicro2415.

14. Rather MA, Gupta K, Mandal M. Microbial biofilm: formation, architecture, antibiotic resistance, and control strategies. Braz J Microbiol 2021;52(4):1701-18. https://doi.org/10.1007/s42770-021-00624-x.

15. Lundin PM, Fiser BL, Blackledge MS, Pickett HL, Copeland AL. Functionalized self-assembled monolayers: versatile strategies to combat bacterial biofilm formation. Pharmaceutics 2022;14(8):1613. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14081613.

16. Stewart PS, Costerton JW Antibiotic resistance of bacteria in bioflms. Lancet 2001;358(9276):135–138. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(01)05321-1).

17. Roy R, Tiwari M, Donelli G, Tiwari V. Strategies for combating bacterial biofilms: A focus on anti-biofilm agents and their mechanisms of action. Virulence 2018;9:522–554. https://doi.org/10.1080/21505594.2017.1313372.

18. Parrino B, Schillaci D, Carnevale I, Giovannetti E, Diana P, Cirrincione G, et al. Synthetic small molecules as anti-biofilm agents in the struggle against antibiotic resistance. Eur J Med Chem 2019;161:154–178. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2018.10.036.

19. Hemmati F, Rezaee MA, Ebrahimzadeh S, Yousefi L, Nouri R, Kafil HS, et al. Novel strategies to combat bacterial biofilms. Mol Biotechnol 2021;63(7):569–86. https://doi.org/10.1007/s12033-021-00325-8.

20. Ghosh A, Jayaraman N, Chatterji D. Small-molecule inhibition of bacterial biofilm. ACS Omega 2020;5(7):3108–15. https://doi.org/10.1021/acsomega.9b03695.

21. Бутов Ю.С., Васенова В.Ю., Возможности применения и терапевтическая эффективность Лонгидазы при патологиях соединительной ткани. Эффективная фармакотерапия Дерматология и Дерматокосметология 2012;(1):40-43. [Butov Yu.S., Vasenova V.Yu., Possibilities of application and therapeutic efficacy of Longidase in connective tissue pathologies. Effektivnaya farmakoterapiya Dermatologiya i Dermatokosmetologiya = Effective pharmacotherapy Dermatology and Dermatocosmetology 2012;(1):40-43. (In Russian)].

22. Зайцев А.В., Ходырева Л.А., Дударева А.А., Пушкарь Д.Ю. Современный взгляд на применение ферментных препаратов у больных хроническим простатитом. Клиническая дерматология и венерология 2016;(3): 53- 60. https://doi.org/10.17116/klinderma201615353-60. [Zaitsev A.V., Khodyreva L.A., Dudareva A.A., Pushkar D.Yu. The use of enzymatic drugs in patients with chronic prostatitis: the current view. Klinicheskaya Dermatologiya i Venerologiya = Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology 2016;(3): 53-60. (In Russian).

23. Bergmans L, Moisiadis P, Van Meerbeek P, Quirynen M, Lambrechts P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. Int Endod J 2005;38(11):775–88. https://doi.org/10.1111/j.1365-2591.2005.00999.x.

24. Hannig C, Follo M, Hellwig E, Al-Ahmad A. Visualization of adherent microorganisms using diferent techniques. J Med Microbiol 2010;59(Pt 1):1–7. https://doi.org/10.1099/jmm.0.015420-0.

25. Grin I, Schwarz H, Linke D. Electron microscopy techniques to study bacterial adhesion. Adv Exp Med Biol 2011;715:257-69. https://doi.org/10.1007/978-94-007-0940-9_16.

26. Keleş, A., Keskin, C., Kalkan, M., Yakupoğulları, Y., Gül, M., Aydemir, H., et al. Visualization and characterization of Enterococcus faecalis biofilm structure in bovine dentin using 2D and 3D microscopic techniques. Arch Microbiol 2020; 203(1):269–277. https://doi.org/10.1007/s00203-020-02031-6.

27. Gupta P, Sarkar S, Das B, Bhattacharjee S, Tribedi P. Biofilm, pathogenesis and prevention—a journey to break the wall. Arch Microbiol 2016;198(1):1-15. https://doi.org/10.1007/s00203-015-1148-6.

28. Авдошин В.П., Андрюхин М.И., Михайликов Т.Г. Опыт применения ферментной терапии (Лонгидаза 3000 МЕ, ректальные суппозитории) в комплексном лечении хронического простатита. Урология 2008;(6):55-61. [Avdoshin V.P., Andryukhin M.I., Mikhailikov T.G. Magneto-laser and enzyme therapy in combined treatment of patients with chronic bacterial prostatitis. Urologiya = Urologiia 2008;(6):55-61. (In Russian)].

29. Кульчавеня Е.В., Швецова О.П., Бреусов А.А. Обоснование назначения и эффективность препарата Лонгидаза у больных хроническим простатитом. Урология 2018;(4):64-71 https://doi.org/https://dx.doi.org/10.18565/urology.2018.4:64-71 [Kulchavenya E.V., Shvetsova O.P., Breusov A.A. Rationale of use and effectiveness of longidaza in patients with chronic prostatis. Urologiya = Urologiia 2018;(4):64-71. (In Russian)].

30. Gatina A, Trizna E, Kolesnikova A, Baidamshina D, Gorshkova A, Drucker V, et al. The Bovhyaluronidase Azoximer (Longidaza^®) Disrupts Candida albicans and Candida albicans-Bacterial Mixed Biofilms and Increases the Efficacy of Antifungals. Medicina (Kaunas) 2022;58(12):1710. https://doi.org/10.3390/medicina58121710.