ВВЕДЕНИЕ

Старение представляет собой одно из самых сложных биологических явлений, которое затрагивает все органы и системы организма человека, в том числе мочевыделительную. В настоящее время не существует единой общепризнанной теории старения, и точные патофизиологические механизмы сенесценции мочевого пузыря еще предстоит выяснить. При этом накапливающиеся научные данные свидетельствуют о том, что старение тесно связано с хроническим низкоуровневым воспалением (low-grade inflammation) [1, 2]. Данная теория воспалительного старения (inflameaging) позволяет по-новому взглянуть на процесс сенесценции. Она подразумевает формирование фенотипа хронического воспаления, сопровождающегося хронической активаций оксидативного стресса и выработкой воспалительных/профибротических цитокинов, в итоге приводящих к развитию фиброзной трансформации тканей (фиброз-опосредованное старение), а на клиническом уровне проявляющегося функциональным дефицитом органов [1, 3].

Цель. Изучить роль свободно-радикального окисления, эндотелиальной дисфункции и низкоуровневого возраст-ассоциированного воспаления как потенциальных факторов клеточной сенесценции в процессе возрастной перестройки детрузора у экспериментальных животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей», «Федерацией европейских ассоциаций по науке о лабораторных животных» и «Международным советом по науке о лабораторных животных». Исследования были разрешены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России (протокол №57 от 19.09.2022 года). Использовались 20 беспородных половозрелых здоровых белых крыс (10 самок и 10 самцов) массой тела 180-200 граммов. Группу 1 (старые животные) составили 10 (5 самок и 5 самцов) белых крыс. Выведение из эксперимента, декапитация и забор биологического материала у них выполнялись в возрасте 30 месяцев с последующим исследованием периферической крови и гомогенатов мочевого пузыря. Группу 2 (молодые животные) составили 10 белых крыс (5 самок и 5 самцов), не подвергавшихся никаким экспериментальным воздействиям. Декапитация и забор биологического материала у них производились в возрасте 10 месяцев.

В качестве маркеров низкоуровневого возраст-ассоциированного воспаления использовали: Фактор некроза опухолей альфа, ФНО-α (Rat Tumor Necrosis Factor Alpha, TNF-α, ELISA Kit, Fine Biotech); Антагонист рецептора интерлейкина-1, АР ИЛ-1 (Rat Interleukin 1 receptor antagonist, IL1RA, ELISA kit, Cusabio); Интерлейкин-6, ИЛ-6 (Rat Interleukin 6, IL-6, ELISA kit, Cusabio). В качестве маркеров эндотелиальной дисфункции использовали: Эндотелин-1, ЭТ-1 (Rat Endothelin 1, ET-1, ELISA kit, Cusabio); Специфическая молекула эндотелиальных клеток-1, СМЭК-1 (Rat Endothelial Cell Specific Molecule 1, ESM1, ELISA kit, Fine Biotech); Интерлейкин - 1 бета, ИЛ-1 бета (Rat Interleukin 1β, IL-1β, ELISA kit, Cusabio). В качестве маркеров фибропластической трансформации (профибротические цитокины) использовали: Трансформирующий ростовой фактор бета-1, ТРФ бета-1 (Rat Transforming Growth Factor β1, TGF-β1, ELISA kit, ELISA kit, Cusabio); Фактор роста соединительной ткани, ФРСТ, (Rat connective tissue growth factor, CTGF, ELISA Kit, Puda Scientific). Для оценки маркеров свободнорадикального окисления выполняли определение уровней: 8-изопростана (методом иммуноферментного анализа, ELISA, производитель Cayman, США), малонового диальдегида (по методу Стальной И.Д. и Гаришвили Т.Г., 1977) [4], каталазы (по методу Aebi, 1984, модифицированного Королюком М.А. и Ивановой Л.И., 1988) [5], а также диеновых конъюгатов (по методике И.Д. Стальной, 1977) ) [6]. Статистическая обработка полученных результатов проводилась по двум группам с помощью пакета программ STATISTICA 10.0 (data analysis software system, StatSoft Inc, 2011). Анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения проводился с использованием критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Для описания нормально распределенных количественных признаков было использовано среднее значение признака и среднее квадратичное отклонение. Для сравнения двух групп с нормальным распределением применялся критерий Стьюдента. Различия и взаимосвязи между признаками считали достоверными при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведена сравнительная оценка статуса низкоуровневого возраст-ассоциированного воспаления (TNF-α, IL-6, IL1RA) в крови и гомогенате стенки мочевого пузыря в группах молодых и старых животных. Результаты раздельного изучения показателей цитокинового статуса представлены в таблице 1.

Таблица 1. Маркеры низкоуровневого возраст-ассоциированного воспаления крови и гомогенате стенки мочевого пузыря
Table 1. Markers of low-level age-associated inflammation in the blood and bladder wall homogenate

Как следует из таблицы 1, средние значения всех показателей низкоуровневого возраст-ассоциированного воспаления, определяемые в крови у старых животных (группа 1), были значительно выше в сравнении с группой молодых животных (группа 2) и во всех случаях достигали статистически значимого уровня различия (p<0,05). Отметим, что по некоторым показателям превалирование над группой контроля составляло более 3-х раз. Выявлена аналогичная статистически достоверная разница между группами молодых и старых крыс по показателям низкоуровневого воспаления гомогената мочевого пузыря.

При анализе статуса эндотелиальной дисфункции крови у экспериментальных животных выявлено, что средние значения всех изучаемых маркеров эндотелиальной дисфункции (ET-1, IL-1β, ESM1), определяемые в крови у старых животных (группа 1), также значительно превышали аналогичные показатели в группе молодых животных (группа 2), во всех случаях достигая статистически значимого уровня различия (p<0,05). Данная статистически значимая разница между группами старых и молодых крыс по исследуемым маркерам (ET-1, IL-1β, ESM1) также наблюдалась при исследовании гомогената стенки мочевого пузыря (табл. 2). 

Таблица 2. Показатели статуса эндотелиальной дисфункции в группах эксперимента и группе контроля
Table 2. Indicators of endothelial dysfunction status in the experimental and control groups

Анализ полученных данных показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ) и системы антиоксидантной защиты у экспериментальных животных показал, что молодые животные контрольной группы в норме имеют невысокие показатели ПОЛ, и, соответственно, активности каталазы как сыворотки крови, так и мочевого пузыря, что свидетельствует о сбалансированности системы антиоксидантной защиты. Также показано, что средние значения продуктов ПОЛ, определяемые в крови у старых животных (группа 1), были значительно выше (для диеновых конъюгатов в 2 раза, для малонового диальдегида в 3,5 раза) в сравнении с группой молодых животных (группа 2) и во всех случаях достигали статистически значимого уровня различия (p<0,05). Одновременно с этим уровень каталазы был выше у старых животных в 1,5 раза как на системном, так и на органном уровнях (гомогенат мочевого пузыря) (табл. 3).

Таблица 3. Перекисное окисление липидов и системы антиоксидантной защиты крови и гомогената стенки мочевого пузыря
Table 3. Lipid peroxidation and antioxidant defense systems of blood and bladder wall homogenate

Анализ первичных данных раздельного изучения профибротического статуса - TGF beta 1 и CTGF (табл. 4), выявил, что средние значения всех изучаемых профибротических цитокинов, определяемых в крови у пожилых крыс (группа 1) были значительно выше в сравнении с группой молодых крыс (группа контроля) и во всех случаях достигали статистически значимого уровня различия (p<0,05). В гомогенате мочевого пузыря зафиксирована аналогичная статистически достоверная разница между группами молодых и пожилых крыс по показателям профибротических цитокинов. 

Таблица 4. Профибротические цитокинов в крови и гомогенате стенки мочевого пузыря
Table 4. Profibrotic cytokines in blood and bladder wall homogenate

ОБСУЖДЕНИЕ

Процесс старения является одним из самых сложных биологических процессов, затрагивающим все системы человеческого организма. В 2000 году итальянскими исследователями была представлена теория «inflammaging» (теория воспалительного старения) [3], согласно которой хроническое низкоуровневое воспаление является неотъемлемым «спутником» старения. Это состояние характеризуется значительным увеличением содержания в крови различных воспалительных медиаторов, включая цитокины, активные формы кислорода, реакционноспособные нитрозирующие соединения, факторы роста и др. Данная провоспалительная «смесь» через паракринные сигнальные пути приводит к негативному воздействию на ремоделирование тканей и, в конечном счете, результируется в фибропластическую трансформацию тканей [7]. В настоящее время все больше данных свидетельствует о том, что хроническое воспаление играет ключевую роль в возрастных дисфункциях и заболеваниях [8]. Однако, несмотря на множество проведенных исследований в данной области, влияние «inflammaging» на старение мочевого пузыря остается малоизученным.

Целью данного исследования стало экспериментальное изучение низкоуровневого воспаления и индуцированной им эндотелиальной дисфункции, окислительного стресса и профибротической активности как на системном, так и на органном (мочевой пузырь) уровнях в эксперименте у молодых и старых крыс. В результате работы было продемонстрировано, что у животных с возрастом уровни как сывороточных, так и тканевых маркеров воспаления (ФНО-альфа, Интерлейкин-6, антагонист рецептора интерлейкина-1), эндотелиальной дисфункции (эндотелин-1, интерлейкин–1 бета, специфическая молекула эндотелиальных клеток-1), перикисного окисления липидов (диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид) и профибротических цитокинов (трансформирующий ростовой фактор бета-1, фактор роста соединительной ткани) повышаются, а уровни антиоксидантной активности (каталаза) статистически значимо снижаются. Эти данные согласуются с результатами исследований, в которых сообщалось, что окислительное повреждение и провоспалительный статус тесно связаны с процессом старения. Так, было показано, что образование активных форм кислорода является решающим элементом в формировании провоспалительного потенциала тканей. [9-11]. P. Davalli и соавт. продемонстрировали, что скорость старения напрямую связана с образованием высоких уровней активных форм кислорода и реакционноспособных нитрозирующих соединений [12]. K. Richter и соавт. выявили аналогичную закономерность и показали, что темпы старения имели прямую корреляцию с уровнями активных форм кислорода (АФК) [13]. Исследование, проведенное R. Lutolf и соавт., продемонстрировало, что провоспалительные цитокины, в частности IL-1β приводят к денервации мочевого пузыря, вызывая его гиперактивность. В исследовании P. He и соавт. сообщалось, что IL-1β повреждает афферентные и эфферентные нейроны, которые опосредуют сокращение детрузора, и оказывает прямое апоптотическое действие на нейроны [14]. В работе L.L. Ren и соавт. указывают на ключевую роль суперсемейства трансформирующих факторов роста бета (TGF-β) в развитии фиброза, ассоциированного со старением (aging-related fibrosis) [15]. На аналогичные результаты ссылаются L. Ferrucci и соавт., указывая, что хроническое низкоуровневое воспаление приводит к формированию профибротического фенотипа, в котором суперсемейство трансформирующих факторов роста бета (TGF-β) играет решающую роль в фибропластической трансформации тканей, ассоциированной со старением [16]. В заключение отметим, что приведенные выше литературные данные согласуются с результатами нашего экспериментального исследования. Таким образом, можно сделать вывод о том, что повышение провоспалительных и профибротических цитокинов, нарушение ПОЛ вероятно являются одними из значимых факторов процесса сенесценции мочевого пузыря, тем самым подтверждая актуальность теории воспалительного старения (inflame-aging) и открывая широкий круг перспектив геропротективной стратегии в урологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хроническое низкоуровневое воспаление, окислительный стресс, эндотелиальная дисфункция и фибропластическая трансформация являются элементами единого патогенетического континуума фиброз-опосредованного воспалительного старения (fibrosis-mediated inflame-aging), играющими ключевую роль в возраст-ассоциированной трансформации мочевого пузыря. 

ЛИТЕРАТУРА

1. Chen L, He PL, Yang J, Yang YF, Wang K, Amend B, et al. NLRP3/IL1β inflammasome associated with the aging bladder triggers bladder dysfunction in female rats. Mol Med Rep 2019;19(4):2960-8. https://doi.org/10.3892/mmr.2019.9919.

2. Baylis D, Bartlett DB, Patel HP, Roberts HC. Understanding how we age: Insights into inflammaging. Longev Healthspan 2013;2:8. https://doi.org/10.1186/2046-2395-2-8. 

3. Franceschi C, Bonafè M, Valensin S, Olivieri F, De Luca M, Ottaviani E, De Benedictis G. Inflamm-aging. An evolutionary perspective on immunosenescence. Ann N Y Acad Sci 2000;908:244-54. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2000.tb06651.x.

4. Стальная И.Д., Гаришвилли Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977, с. 66–68. [Stal'naya I.D., Garishvilli T.G. Method for the determination of malondialdehyde using thiobarbituric acid. Modern methods in biochemistry. M.: Medicina, 1977, p. 66–68. (In Russian)].

5. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарева В.Е. Метод определения активности каталазы. Лабораторное дело 1988;1:16-9. [Korolyuk M.A., Ivanova L.I., Mayorova I.G., Tokareva V.E. Method for determining catalase activity. Laboratornoye delo = Laboratory Science 1988;1:16-9. (In Russian)].

6. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот. Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977, p. 63–64. [Steel I.D. Method for determining diene conjugation of unsaturated higher fatty acids. Modern methods in biochemistry. M.: Medicine, 1977. p. 63–64. (In Russian)].

7. Uyar B, Palmer D, Kowald A, Murua Escobar H, Barrantes I, Möller S, et al. Single-cell analyses of aging, inflammation and senescence. Ageing Res Rev 2020;64:101156. https://doi.org/10.1016/j.arr.2020.101156.

8. Di Micco R, Krizhanovsky V, Baker D, d'Adda di Fagagna F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nat Rev Mol Cell Biol 2021;22(2):75-95. https://doi.org/10.1038/s41580-020-00314-w.

9. Bektas A, Schurman SH, Sen R, Ferrucci L. Aging, inflammation and the environment. Exp Gerontol 2018;105:10-8. https://doi.org/10.1016/j.exger.2017.12.015.

10. Torres KCL, Rezende VB, Lima-Silva ML, Santos LJS, Costa CG, Mambrini JVM, et al. Immune senescence and biomarkers profile of Bambuí aged population-based cohort. Exp Gerontol 2018;103:47-56. https://doi.org/10.1016/j.exger.2017.12.006.

11. Sies H, Berndt C, Jones DP. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem 2017;86:715-48. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-061516-045037.

12. Davalli P, Mitic T, Caporali A, Lauriola A, D'Arca D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxid Med Cell Longev 2016;2016:3565127. https://doi.org/10.1155/2016/3565127.

13. Richter K, Kietzmann T. Reactive oxygen species and fibrosis: further evidence of a significant liaison. Cell Tissue Res 2016;365(3):591-605. https://doi.org/10.1007/s00441-016-2445-3.

14. Lutolf R, Hughes FM, Jr., Inouye BM, Jin H, McMains JC, Pak ES, et al. NLRP3/IL-1beta mediates denervation during bladder outlet obstruction in rats. Neurourology and urodynamics 2017. Neurourol Urodyn 2018;37:1506. https://doi.org/10.1002/nau.23478.

15. Ren LL, Miao H, Wang YN, Liu F, Li P, Zhao YY. TGF-β as A Master Regulator of Aging-Associated Tissue Fibrosis. Aging Dis 2023;14(5):1633-50. https://doi.org/10.14336/AD.2023.0222.

16. Ferrucci L, Fabbri E. Inflammageing: chronic inflammation in ageing, cardiovascular disease, and frailty. Nat Rev Cardiol 2018;15(9):505-22. https://doi.org/10.1038/s41569-018-0064-2.