ВВЕДЕНИЕ

В условиях роста антибиотикорезистентности микроорганизмов вообще и возбудителей урологической инфекции в частности, а также с учетом специфики развития урологической инфекции, связанной с персистенцией микроорганизмов в клетках слизистой оболочки мочевого пузыря при рецидивирующем цистите; в биопленках внутри инфекционных камней почек, на уретральных катетерах, стентах; бессимптомной бактериурией, актуален поиск альтернативных методов, направленных на улучшение результатов лечения пациентов с хронической инфекцией мочевыводящих путей [1]. В настоящее время в клинической практике в качестве альтернативы антибиотикотерапии широко используют препараты бактериофагов [2-11].

Терапевтическое действие бактериофагов существенно отличается от антибиотиков, что делает их активными в отношении бактерий с множественной лекарственной устойчивостью [12]. Природа представляет почти бесконечный ресурс фагов: при необходимости для большинства видов проблемных бактерий можно выделить новые фаги. Бактерии и их фаги постоянно эволюционируют совместно, это важно, поскольку появляются новые варианты патогенных бактерий и возникают новые сложные ситуации. В терапии заболеваний человека «коктейли» из нескольких фагов могут снизить число бактерий, у которых развилась устойчивость к определенному фагу [13].

Препараты бактериофагов должны содержать облигатно вирулентные фаги, хорошо охарактеризованные и высокоочищенные. На фаговых производствах коллекция бактериофагов и маточных микроорганизмов постоянно обновляется из различных источников: сточных вод, болот, рек, различных больниц всей страны. Однако для повышения литической активности препаратов бактериофагов к условиям конкретного стационара необходим постоянный контроль чувствительности основных возбудителей инфекции к коммерческим препаратам бактериофагов и регулярная работа по обновлению (адаптации) коммерческих препаратов терапевтических бактериофагов.

Цель работы: улучшить литическую активность коммерческих препаратов бактериофагов, адаптировать их к возбудителям конкретного стационара – НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России (далее НИИ урологии).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В НИИ урологии в 2022 году было выполнено 6162 культуральных исследований мочи у амбулаторных (2017) и стационарных (1476) пациентов с различными урологическими заболеваниями.

Микробиологические анализы выполняли на анализаторе Phoenix TM M50 (система для идентификации микроорганизмов и определения чувствительности к антимикробным препаратам) компании Becton Dickinson (Великобритания).

Фенотипы антибиотикорезистентности микроорганизмов в стационаре НИИ урологии и фагоустойчивость уропатогенов в 2022 г. определили у 3493 микроорганизмов.

Для улучшения литического действия коммерческих препаратов бактериофагов к уропатогенам мы периодически отправляли выделенные штаммы микроорганизмов на фаговое производство Так, еще в 2017 году 100 штаммов E.coli (как основного возбудителя мочевой инфекции), выделенных из мочи урологических пациентов, отосланы на фаговое производство НПО «Микроген» в г. Уфа, где проводилась адаптация (подбор) бактериофагов к кишечной палочке.

На фаговом производстве проводили подбор бактериофагов к штаммам кишечной палочки из НИИ урологии таким образом, чтобы бактерии лизировались маточными фагами по методу Аппельмана в титрах не менее, чем на 1-2 порядка выше показателей специфической активности конечного продукта. При этом стабильность лизиса сохранялась после 48±3 часов инкубирования при температуре 37,0° С. При определении специфической активности готовых препаратов бактериофагов, в качестве контрольных, отбирались штаммы из коллекции производственных штаммов бактерий; они не использовались при производстве данной серии препарата. После адаптации получено повышение литической активности бактериофагов к E.coli на 14% (с 78% до 92%).

В дальнейшем ежегодно (кроме перерыва во время пандемии COVID-19) штаммы основных уропатогенов, выделенных из мочи больных с урологическими заболеваниями, регулярно отсылались на фаговое производство.

Для повышения литической активности препаратов бактериофагов необходимо обновление их бактериофагами из сточных вод конкретного стационара. Мы дважды в 2022 г. забирали сточные воды из клинического корпуса НИИ урологии в объеме 10 литров (2 канистры по 5 литров), которые отправляли на фаговое производство в г. Уфа (рис. 1), где из них выделяли бактериофаги. На фаговом производстве проведена адаптация (обновление) коммерческих препаратов бактериофагов фагами из сточных вод клинического корпуса нашего института.

Рис.1. Забор сточных вод из клинического корпуса НИИ урологии
Fig. 1. Wastewater intake from the clinical building of the Research Institute of Urology

РЕЗУЛЬТАТЫ

По результатам 6162 культуральных анализов мочи (посевы), полученных от урологических пациентов НИИ урологии на протяжении 2022 г., всего выделено 3493 микроорганизма. На рисунке 2 представлены данные посевов мочи от амбулаторных (n=2017) и стационарных пациентов (n=1476) НИИ урологии за 2022 г.

Рис. 2. Микроорганизмы, выделенные из мочи пациентов с урологическими заболеваниями, НИИ урологии, 2022 г.
Fig. 2. Microorganisms isolated from the urine of patients with urological diseases, Research Institute of Urology, 2022

Среди фенотипов антибиотикорезистентности у микроорганизмов в нашем стационаре наиболее часто (11,6%) определяли бета-лактамазы расширенного спектра действия (БЛРС, ESBL), метициллин-резистентный золотистый стафилококк (MRSA) в 8,4%, ванкомицин-резистентные энтерококки (VRE) в 0,6%, карбапенем-резистентные энтеробактерии (CRE) в 4,5% случаев. Также в стационаре института определили и устойчивость к препаратам бактериофагов (PhR), которая составила 16,3%.

Резистентность уропатогенов, полученных от амбулаторных пациентов в поликлинике НИИ урологии, составила: MRSA 9,9%, БЛРС – 5,3%, ванкомицин-резистентные энтерококки – 0,2%, карбапенем-резистентные энтеробактерии – 1,7%, резистентность к бактериофагам составила 4,0% (рис. 3).

Рис. 3. Фенотипы (MRSA, ESBL,VRE, CRE) резистентности к антибиотикам и препаратам бактериофагов (PhR), НИИ урологии, 2022 г.
Fig. 3. Phenotypes (MRSA, ESBL, VRE, CRE) of resistance to antibiotics and bacteriophage drugs (PhR), Research Institute of Urology, 2022
Примечание:
​• MRSA – метициллин-резистентный золотистый стафилококк
• ESBL – бета-лактамазы расширенного спектра действия
• VRE – ванкомицин резистентные энтерококки
• CRE – карбапенем-резистентные энтеробактерии
• PhR – устойчивость к бактериофагам

Наиболее проблемными микроорганизмами – возбудителями урологической инфекции – в настоящее время являются E.coli, Klebsiella spp., Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. На рисунках 4 и 5 представлены фенотипы резистентности этих уропатогенов.

Рис. 4. Фенотипы антибиотикорезистентности и фагоустойчивость уропатогенов в стационаре НИИ урологии в 2022 г.
Fig.4. Phenotypes of antibiotic resistance and phage resistance of uropathogens in the hospital of the Research Institute of Urology in 2022.
Примечание:
• ESBL – бета-лактамазы расширенного спектра действия
• CRE – карбапенем-резистентные энтеробактерии
• PhR – фагоустойчивость
• MSSA – метициллин-чувствительный золотистый стафилококк

Рис. 5. Фенотипы резистентности и фагоустойчивость уропатогенов в поликлинике НИИ урологии в 2022 г.
Fig. 5. Resistance phenotypes and phage resistance of uropathogens in the outpatient clinics of the Research Institute of Urology in 2022
Примечание:
• ESBL – бета-лактамазы расширенного спектра действия
• CRE – карбапенем-резистентные энтеробактерии
• PhR – фагоустойчивость
• MSSA – метициллин-чувствительный золотистый стафилококк

Чувствительность и устойчивость уропатогенов к антимикробным препаратам по данным лаборатории микробиологии НИИ урологии в 2022 году представлены в таблице 1. В течение 2022-2023 гг. мы также ежемесячно отправляли на фаговое производство отсеянные штаммы выделенных возбудителей урологической инфекции, после чего был получен лиофилизат, на основе которого были изготовлены адаптированные препараты бактериофагов. Получено повышение литической активности препарата пиобактериофага поливалентного «Секстафаг», содержащего в 1 мл стерильные очищенные фильтраты фаголизатов бактерий Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Proteus (P.vulgaris, P.mirabilis), Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, к уропатогенным штаммам E.coli на 16% (с 48% до 64%).

Таблица 1. Чувствительность и устойчивость уропатогенов к антимикробным препаратам по данным лаборатории микробиологии НИИ урологии в 2022 году
Table 1. Sensitivity and resistance of uropathogens to antimicrobial drugs according to the microbiology laboratory of the Research Institute of Urology in 2022

Примечание: * - не определяли чувствительность
Note: * - sensitivity was not determined

ОБСУЖДЕНИЕ

По данным культурального исследования мочи амбулаторных и стационарных пациентов, в НИИ урологии в 2022 г чаще всего выделяли Enterococcus faecalis (22,6%). Далее следует во внебольничной среде – Staphylococcus haemolyticus (18%), Escherichia coli (13,5%), Staphylococcus epidermidis (6,9%), Staphylococcus aureus (4,2%), Corynebacterium spp. (3,7%), Klebsiella pneumoniae (3,2%), Staphylococcus agalactiae группа В (2,2%) и Klebsiella spр. (1,9%). У стационарных пациентов выделены следующие микроорганизмы: Escherichia coli (17,6%), Klebsiella pneumoniae (6,3%), Staphylococcus epidermidis (5,4%), Pseudomonas aeruginosa (4,5%), Staphylococcus haemolyticus (4,4%), Staphylococcus saprophyticus (3,4%), Klebsiella spр. (2,8%), Staphylococcus aureus (2,7%) и Proteus mirabilis (2,6%).

Такое бактериальное разнообразие, особенно грамположительной флоры (энтерококки, стафилококки), не должно смущать врачей урологов. Эти микроорганизмы, как правило, не являются возбудителями инфекций мочевых путей, как внебольничных, так и инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП). Частота появления фекального энтерококка в моче может отражать частое использование в клинической практике антибиотиков группы цефалоспоринов и хинолонов/фторхинолонов, которые не действуют на энтерококки (природная устой-чивость) [13]. Наличие Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp., Staphylococcus agalactiae может отражать неправильный сбор мочи для анализа, несоблюдение санитарно-гигиенических требований, в результате которого в мочу попадают микроорганизмы с кожи, слизистых оболочек, из влагалища и передней части уретры [1].

Широкое необоснованное назначение врачами антибактериальных препаратов при обнаружении бактерий в моче при отсутствии клинических признаков инфекционно-воспалительного заболевания (бессимптомная бактериурия), особенно на фоне конкрементов, дренажей, стентов способствует селекции антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, выработке ими различных механизмов антибиотикорезистентности [14, 15]. Анализ данных антибиотико- и фагоустойчивости уропатогенов за 2022 год свидетельствует о мультирезистентных микроорганизмах в нашей клинике. В условиях возникновения тяжелых инфекционно-воспалительных заболеваний, чаще послеоперационных, вызванных антибиотикорезистентными уропатогенами, назначение эффективной антибиотикотерапии становится проблемным. В современных условиях, а также при отсутствии поступления новых зарубежных антибактериальных препаратов в нашу страну, конечно, проводится работа по поиску альтернативных антибиотикам лекарственных препаратов, в частности бактериофагов. Неоспоримым преимуществом фаготерапии перед химическими антимикробными препаратами является использование эволюционного потенциала фагов в качестве противовеса адаптационным возможностям патогенных бактерий (16). Хотя устойчивость бактерий к любому конкретному вирусу возникает гораздо легче, чем к антибиотикам, практически всегда возможно относительно легко подобрать новый фаг, который будет активен против резистентного штамма. Важно, что корреляции между устойчивостью к фагам и антибиотикам не наблюдается, поэтому даже мультирезистентные и панрезистентные штаммы, не являются более сложными в смысле подбора активных против них фагов, чем обычные штаммы возбудителей [16]. Главным преимуществом фаговой терапии является возможность использования природного разнообразия фагов путем быстрого выделения новых фаговых изолятов, активных против актуальных возбудителей, и их оперативного включения в терапевтические коктейли [17-23].

Опасения касательно способности фагов осуществлять трансдукцию генетического материала, а также роли умеренных фагов в патогенности многих возбудителей требуют гарантии исключения присутствия в препаратах умеренных фагов и побдора для использования в терапии фагов, не способных к общей трансдукции генов [16].

Для улучшения качества отечественных препаратов бактериофагов компания НПО «Микроген» постоянно улучшает свои препараты. Они подбирают и создают специальные производственные штаммы, сохраняющие чувствительность к бактериофагам, которые необходимо ввести в состав препарата, но не несущие активных профагов. Регулярно проводится контроль качества фаговых препаратов, непрерывный мониторинг состава циркулирующих штаммов соответствующих возбудителей и оперативная замена фагов в составе препаратов для обеспечения достаточного спектра активности.

Целевой спектр активности коммерческих препаратов бактериофагов должен быть не менее 70%, однако, как показано в таблице 1, реальная чувствительность уропатогенов к препаратам бактериофагов значительно ниже – от 14,3 до 62,4%. В связи с этим возникает потребность регулярного обновления коктейля фагов с целью адаптации коммерческих препаратов бактериофагов к условиям бактериологического пейзажа конкретного стационара.

Коллекция штаммов бактерий НПО Микроген в настоящее время составляет более 18 000 штаммов со всей территории РФ, из них более 7 000 поступили в последние 3 года. Адаптация (обновление) препаратов бактериофагов происходит регулярно, после адаптации процент чувствительности уропатогенов из клиники НИИ урологии к коммерческим препаратам бактериофагов в августе 2023 г. увеличился в среднем на 20-30%, что нашло отражение в клинической эффективности бактериофаготерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для улучшения литической активности препаратов бактериофагов и повышения эффективности лечения урологической инфекции необходимо постоянно обновлять состав коктейля коммерческих препаратов бактериофагов фагами, к которым чувствительны свежевыделенные штаммы уропатогенов из сточных вод больниц и производственной коллекции фагов, а также отсылать для обновления коммерческих препаратов на производство отсеянные возбудители от пациентов с урологической инфекцией.

ЛИТЕРАТУРА

1. Перепанова Т.С., Козлов Р.С., Руднов В.А., Синякова Л.А., Палагин И.С. Антимикробная терапия и профилактика инфекций почек, мочевыводящих путей и мужских половых органов. Федеральные Клинические рекомендации, Издательский дом «УроМедиа», Москва, 2022, 126 с. [Perepanova T.S., Kozlov R.S., Rudnov V.A., Sinyakova L.A., Palagin I.S. Antimicrobial therapy and prevention of infections of the kidneys, urinary tract and male genital organs. Federal Clinical Guidelines, UroMedia Publishing House, Moscow, 2022, 126 p. (In Russian)].

2. Перепанова Т.С., Дарбеева О.С., Котлярова Г.А., Кондратьева Е.М., Майская Л.М., Малышева В.Ф. и соавт. Эффективность препаратов бактериофагов при лечении воспалительных урологических заболеваний. Урология и нефрология 1995;(5):14-7. [Perepanova T.S., Darbeeva O.S., Kotlyarova G.A., Kondratyeva E.M., Maiskaya L.M., Malysheva V.F., et al. The effectiveness of bacteriophage preparations in the treatment of inflammatory urological diseases. Urologija i nefrologija = Urology Nefrology 1995;(5):14-7. (In Russian)].

3. Акимкин В.Г., Дарбеева О.С., Колков В.Ф. Бактериофаги: исторические и современные аспекты их применения: опыт и клинические перспективы. Клиническая практика 2010;(4):48–54. [Akimkin V.G., Darbeeva O.S., Kolkov V.F. Historical and modern aspects of bacteriophages application: experience and prospects. Klinicheskaya praktika = Journal of Clinical Practice 2010;(4):48–54. (In Russian)].

4. Зоркин С.Н., Шахновский Д.С. Возможности бактериофаготерапии при лечении больных с осложненной инфекцией мочевых путей. Педиатрическая фармакология 2013;10(4):132-8. [Zorkin S.N., Shakhnovskiy D.S. Possibilities of bacteriophage therapy in the treatment of patients with complicated urinary tract infection. Pediatricheskaya Farmakologiya = Pediatric Pharmacology 2013;10(4):132-8. (In Russian)]. https://doi.org/10.15690/pf.v10i4.767.

5. Каттер Э., Сулаквелидзе А. Бактериофаги. Биология и практическое применение. Научный мир 2012 г., 640 c. [Cutter E., Sulakvelidze A. Bacteriophages. Biology and practical applications. Nauchnyy mir 2012, 640 p. (In Russian)].

6. Перепанова Т.С., Казаченко А.В., Хазан П.Л., Малова Ю.А. Терапевтическое применение бактериофагов: назад в будущее. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2021;23(1):55-66. [Perepanova T.S., Kazachenko A.V., Khazan P.L., Malova Yu.A. Bacteriophage therapy: back to the future. Klinicheskaia mikrobiologiia i antimikrobnaia khimioterapiia = Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy 2021;23(1):55-66. (In Russian)]. https://doi.org/10.36488/cmac.2021.1.55-64.

7. Алешкин А.В., Селькова Е.П., Ершова О.Н., Савин И.А., Шкода А.С., Бочкарева С.С. и соавт. Концепция персонализированной фаготерапии пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии, страдающих инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Фундаментальная и клиническая медицина 2018;3(2):66-73. [Aleshkin A.V., Sel’kova E.P., Ershova O.N., Savin I.A., Shkoda A.S., Bochkareva S.S., et al. Concept of personalized phage therapy for intensive care unit patients with healthcare-associated infections. Fundamental'naya i klinicheskaya medicina = Fundamental and Clinical Medicine 2018;3(2):66-73. (In Russian)]. https://doi.org/10.23946/2500-0764-2018-32-66-74.

8. Myelnikov D. An alternative cure: The adoption and survival of bacteriophage therapy in the USSR, 1922-1955. J Hist Med Allied Sci 2018;73(4):385-411. https://doi.org/10.1093/jhmas/jry024.

9. Willy C, Bugert JJ, Classen AY, Deng L, Düchting A, Gross J, et al. Phage Therapy in Germany - Update 2023. Viruses 2023;15(2):588. https://doi.org/10.3390/v15020588.

10. Cesta N, Di Luca M, Corbellino M, Tavio M, Galli M, Andreoni M. Bacteriophage therapy: an overview and the position of Italian society of infectious and tropical diseases. Infez Med 2020;28(3):322-31.

11. Chanishvili N. Bacteriophages as therapeutic and prophylactic means: summary of the soviet and post-soviet experiences. Curr Drug Deliv 2016;13(3):309-23. https://doi.org/10.2174/156720181303160520193946.

12. Rohde C, Wittmann J, Kutter E. Bacteriophages. A therapy concept against multi-drug-resistant bacteria. Surg Infect (Larchmt) 2018;19(8):737-44. https://doi.org/10.1089/sur.2018.184.

13. Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н., редакторы. Антибактериальная терапия. Практическое руководство. Москва, 2000, 191 с. [Strachunsky L.S., Belousov Yu.B., Kozlov S.N. editors. Antibacterial therapy. Practical guide. Moscow, 2000, 191 p. (In Russian)].

14. Jose-Luis Capelo-Martinez, Gilberto Igrejas, editors. Antibiotic drug resistance. First Edition 2020, John Wiley&Sons, Inc. 692 p.

15. WHO. Global Antimicrobial Resistance and Use Surveillance System (GLASS) Report. [Electronic resourse]. URL: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/341666/9789240027336-eng.pdf

16. Летаров А.В. Современные концепции биологии бактриофагов. М.: ТД ДеЛи, 2019. 384 с. [Letarov A.V. Modern concepts of the biology of bacteriophages. M.: TD DeLi, 2019. 384 p. (In Russian)].

17. Dabrowska K. Phage therapy: What factors shape phage pharmacokinetics and bioavailability? Systematic and critical review. Med Res Rev 2019;39(5):2000-25. https://doi.org/10.1002/med.21572.

18. Rotman SG, Sumrall E, Ziadlou R, Grijpma DW, Richards RG, Eglin D, Moriarty TF. Local bacteriophage delivery for treatment and prevention of bacterial infections. Front Microbiol 2020;11:538060. https://doi.org/10.338/fmicb.2020.538060.

19. Crum E, Merchant Z, Ene A, Miller-Ensminger T, Johnson G, et al. (2023) Coliphages of the human urinary microbiota. PLOS ONE 2023;18(4):e0283930. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0283930.

20. Яковец Е.А., Монастырева К.А., Чудновец И.Ю., Трутнев В.П. Сравнительная оценка эффективности лечения пациенток с хроническим рпецидивирующим циститом, осложненным инфекцией мочевыводящих путей. Фармакология & Фармакотерапия 2023;(1):66-69. [Yakovets E.A., Monastyreva K.A., Chudnovets I.Yu., Trutnev V.P. Comparative evaluation of treatment effectiveness in patients with chronic recurrent cystitis complicated by urinary tract infection. Farmakologiya i Farmakoterapiya = Pharmacology and Pharmacotherapy 2023;(1):66-9. (In Russian)]. https://doi.org/10.46393/27132129_2023_1_66.

21. Mukane L, Racenis K, Rezevska D, Petersons A, Kroica J. Anti-biofilm effect of bacteriophages and antibiotics against uropathogenic Escherichia coli. Antibiotics 2022;11(12):1706. https://doi.org/10.3390/antibiotics11121706.

22. Kok DN, Turnbull J, Takeuchi N, Tsourkas PK, Hendrickson HL. In vitro evolution to increase the titers of difficult bacteriophages. PAMP-UP Protocol. Phage: (New Rochelle) 2023;4(2):68-81. https://doi.org/10.1089/phage.2023.0005

23. Yukgehnaish K, Rajandas H, Parimannan S, Manickam R, Marimuthu K, Petersen B, et al. Phage Leads: Rapid assessment of phage therapeutic suitability using an ensemble machine learning approach. Viruses 2022;14(2):342. https://doi.org/10.3390/v14020342.